Sekvenování DNA

Frederick Sanger, autor jedné z dodnes používaných metod sekvenování DNA

Ještě na začátku sedmdesátých let bylo určení pořadí nukleotidů velmi obtížné a obvykle se provádělo nepřímo, tedy sekvenováním RNA molekul či proteinů.[2] První sekvenování krátké sekvence DNA provedl v roce 1970 Ray Wu z Cornellské univerzity; tato sekvence se však skládala z pouhých 12 nukleových bází a pocházela z okrajových regionů genomu viru lambda. Práce Wuovi a jeho spolupracovníkovi trvala 3 roky.[3]

Průlom nastal v druhé polovině 70. let. V roce 1975 vyvinul svou sekvenační metodu Frederick Sanger a A. R. Coulson.[4] Allan Maxam a Walter Gilbert vyvinuli další, poměrně rychlou metodu sekvenování DNA v roce 1977[4] a druhý jmenovaný dostal za svou vědeckou činnost v roce 1980 Nobelovu cenu.[5] V počátcích sekvenování bylo možno osekvenovat za den jen několik tisíc nukleových bází a sekvenování celého genomu bylo velice náročné. Postupně však byly metody modernizovány a dnes má vědecká veřejnost k dispozici v databázích sekvence DNA čítající několik stovek miliard nukleových bází.[6] Prvním zcela osekvenovaným genomem byl genom bakterie Haemophilus influenzae, dnes však je k dispozici široké rozpětí genomů různých jiných organizmů.[2] V roce 2001 byla zveřejněna první podoba genomu člověka,[7][8] poslední data však byla publikována až v roce 2006.[9]

Při zjišťování pořadí nukleotidů v DNA, popřípadě v RNA, lze uplatnit několik různých principů. Různé metody sekvenování můžou využívat i stejných principů.

• sekvenace štěpením – sekvenace se dosáhne sekvenčně specifickým chemickým nebo biochemickým štěpením vlákna DNA a následnou charakterizaci fragmentů
• sekvenace syntézou – techniky využívající DNA polymerázu a sledující identitu nebo pozici nukleotidů v syntetizovaných fragmentech; pro účely sledování jsou nukleotidy nebo fragmenty značeny buď izotopy nebo fluorescenčně
• sekvenace ligací – podobné sekvenaci syntézou, ale vznik delších fragmentů je zabezpečován aktivitou DNA ligázy
• sekvenace hybridizací – detekce nukleotidů probíhá na základě jejich schopnosti vázat se na (hybridizovat se) sondami (vlákny DNA se známou sekvencí)
• sekvenace na pórech – identifikace nukleotidů probíha na základě změny elektrického proudu procházejícího pórem umístěným v jinak nepropustné membráně, kterým v době měření prochází molekula DNA
• sekvenace mikroskopem – sekvenace spočívá ve vizualizaci vlákna DNA na úrovni zvětšení, kde už lze odlišit od sebe různé báze

Maxamova–Gilbertova metoda. Z této elektroforézy je patrné, že sekvence DNA zní GTCATAGCA (čte se zespodu)

Bylo vyvinuto poměrně velké množství technik sloužících k sekvenování DNA, které se liší některými základními principy a dále především cenou a rychlostí. Dvěma základními metodami jsou Maxamovo-Gilbertovo sekvenování a Sangerovo sekvenování.[4][10] Obě mají společné to, že využívají k roztřídění sekvencí gelovou elektroforézu; liší se však způsoby, jak tyto sekvence vznikají. Sangerova metoda je výhodnější zejména v tom, že se při ní do takové míry nemusí využívat toxické látky. Modernizací Sangerovy metody je také možné sekvenování zjednodušit či zrychlit (fluorescenční obarvování atd.).[3]

Sangerova metoda

Elektroforéza, na níž je patrný výsledek Sangerova sekvencování

Podrobnější informace naleznete v článku Sangerova metoda sekvenování.

Sangerova metoda (též označována jako metoda „plus a minus“, „dideoxy“ metoda či metoda „primed synthesis“) je použitelná k sekvenování krátké sekvence jednovláknové DNA. V podstatě využívá biologického procesu replikace DNA. Vybraná sekvence se vloží do reakční směsi, jež obsahuje vhodný radioaktivně označený primer (α-P³²-dATP), DNA polymerázu (Taq či T7 polymeráza), zásobu čtyř esenciálních deoxyribonukleotidů (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), ale navíc také jeden ze čtyř dideoxynukleotidů. Dideoxynukleotid je schopen se začlenit do replikující se DNA, ale následně zastaví elongaci řetězce, protože nemá OH skupinu, na níž by se připevnil další nukleotid. Každý dideoxynukleotid se vloží do jedné ze čtyř nádob se vzorkem a všechny replikované sekvence v dané nádobě tedy zákonitě skončí dideoxynukleotidem svého typu.[10]

Výsledkem je směs různě dlouhých sekvencí DNA, které začínají radioaktivním primerem a končí daným dideoxynukleotidem. Když se seřadí na elektroforéze (podobně jako u metody Maxam–Gilbert) podle délky, můžeme snadno porovnáním čtyř vedle sebe umístěných elektroforetických gelů zjistit, jak za sebou následovaly nukleové báze ve zkoumané sekvenci DNA.

Sangerova metoda má mnoho alternativ. Podle jednoho protokolu se do nádob nepřidávají dideoxynukleotidy, nýbrž vždy všechny deoxynukleotidy (dNTP) vyjma jednoho – syntéza dané sekvence skončí tehdy, následuje–li právě ta nukleová báze, která není k dispozici v reakční směsi. „Plus“ metoda zase pracuje v každé nádobě pouze s jedním deoxynukleotidem – sekvence se vytvoří tehdy, je–li na řadě právě tento deoxynukleotid.[4] Revolučním krokem je další metoda, která zase využívá fluorescenční barviva navázaná na jednotlivé dideoxynukleotidy. Tato metoda je však v principu opět podobná Sangerovu původnímu protokolu – prodlužování sekvence skončí, když se naváže jeden z dideoxynukleotidů. Má však výhodu v tom, že je možné místo čtyř zkumavek použít jenom jedinou, protože při elektroforéze jsou jednotlivé nukleové báze označené různými fluorescenčními barvami. Tato tzv. kapilární elektroforéza může být do velké míry automatizována a tedy velice zrychlena.[12]

Pyrosekvenování

Výstup programu po proběhlém pyrosekvenování

Podrobnější informace naleznete v článku Pyrosekvenování.

Pyrosekvenování (angl. pyrosequencing) je jedna z novějších metod sekvenování DNA. Je sice (podobně jako Sangerova metoda) založena také na syntéze nových sekvencí DNA, ale liší se způsobem, jak je detekováno začlenění daného nukleotidu (nevyžaduje elektroforézu).[13] Pyrosekvenování vyvinul v roce 1996 ve Stockholmu profesor Pål Nyrén se svým studentem Mostafou Ronaghi.[14][15][16] Ve směsi pro pyrosekvenování musí být přítomno velké množství enzymů, mimo DNA polymerázy ještě ATP sulfuryláza, luciferáza a apyráza; ze substrátů pak adenosinfosfosulfát a luciferin. Do této směsi jsou postupně vkládány nukleotidy různých typů (dATP, dGTP, dCTP, dTTP). Když se po přidání jednoho z nich uvolní světelné záření, znamená to, že se do vznikajícího řetězce začlenil jeden nebo více nukleotidů tohoto typu. Toto světlo zde vzniká v důsledku enzymatické reakce, na jejímž začátku je uvolnění pyrofosfátu z nově začleněného nukleotidu a na jejímž konci je spotřeba vzniklého ATP luciferázou k oxidaci luciferinu (viz video na stránkách výrobce).[17] Před přidáním dalšího nukleotidu je původní nukleotid (již obsažený v roztoku) rozložen.

Genomy jsou zpravidla velmi rozsáhlé a jejich sekvenování nukleotid po nukleotidu není ani při použití nejmodernějších postupů otázkou okamžiku. Dalším omezením je cena: sekvenování lidského genomu (Human Genome Project) stálo téměř tři miliardy amerických dolarů,[22] nově patentované technologie se však snaží srazit tuto částku na 100 000 dolarů, v některých případech dokonce na pouhých 1000 dolarů.[6] Běžné sekvenovací metody navíc využívají obvykle separaci pomocí elektroforézy, a tak dokážou přečíst na jeden zátah pouze několik stovek[23] (udává se 300–800[24]) nukleových bází. Existuje však několik strategických metod, jak přečíst toto obrovské množství genetického materiálu:

• „Whole–genome shotgun“ metoda – při této metodě se genom rozštípe na náhodně velké fragmenty, každý z nich se osekvenuje a následně se tyto sekvence seřadí (pomocí počítačového softwaru). Toto seřazení však komplikují různé repetitivní úseky.[23] Navíc je nutné celý genom v podstatě osekvenovat několikrát (asi 7–9krát[24]), aby jednotlivé sekvence dostatečně přesahovaly a bylo možné podle těchto přesahů sestavit genom.
• BAC sekvenování („Clone-by-clone“) – využívá se tzv. BAC plazmidů (BAC – bacterial artificial chromosome). Postup je poněkud opačný, než u předchozí metody. Nejprve se vytvoří jakási mapa celého genomu, jež rozdělí tento genom na sekvence o délce asi 150 000 párů bází, každá jednotlivá sekvence se vloží do bakterie v podobě uměle připraveného plazmidu, načež se jednotlivé klony mohou sekvenovat – a to vlastně shotgunovou metodou v malém měřítku. Výhodou je, že u této metody odpadá často složitá práce se seřazováním obrovského množství sekvencí, jako u předchozí metody.[23]

Vhodným měřítkem k porovnávání rychlosti jednotlivých metod sekvenování DNA je lidský genom. Před deseti lety trvalo Celera Genomics a HGP několik let, než přečetli genom člověka. V roce 2008 byl genom Jamese Watsona přečten za pouhých několik měsíců. Nové technologie, které se pomalu dostávají do ruky vědcům, slibují, že bude již brzy možné stejnou práci vykonat v řádu minut.[25] Archon X Prize je ocenění spojené s finanční prémií 10 milionů dolarů, které získá tým, jež bude schopen s dostatečnou přesností osekvenovat 100 lidských genomů během 10 dní, a to za cenu nanejvýš 10 000 dolarů na jeden osekvenovaný genom.[26]

Fylogenetický strom všech eukaryotických organizmů je konstruován právě srovnáváním částí DNA, které jsou nejprve osekvenovány

Sekvenování DNA má množství aplikací ve vědě, medicíně i například v zemědělství. Sekvenují se celé genomy, případně jenom některé části, které mají pro daný obor význam. Například pro studium evolučního vývoje organizmů se zpravidla sekvenuje DNA, jež kóduje ribozomální RNA. V kriminalistice zase mají význam repetitivní oblasti DNA zvané mikrosatelity. Někdy se sekvenují jen ty části genomu, které kódují geny: tato filosofie se nazývá EST (expressed sequence tag).

V lékařství slibuje sekvenování DNA například revoluci v diagnostice chorob a časnému zjištění náchylnosti jedince k určitým nemocem (rakovina, kardiovaskulární onemocnění). Usnadňuje se také výroba léků – vědci mohou zacílit lék proti konkrétnímu produktu konkrétního genu. Podle genotypu jedince může být vybírán správný léčebný postup. Pokud bude zjištěna jistá genetická porucha, nabízí se v budoucnosti rovněž možnost genové terapie.[27]

Ve fylogenetice představuje DNA sekvenování možnost studovat fylogenezi (evoluční vývoj) organizmů. Antropologie zase využívá srovnávání DNA k zjišťování migrací lidských ras (zejména podle mitochondriální DNA a Y-chromozomální DNA). Ve forenzních vědách může osekvenovaná DNA působit jako důkaz něčí viny či neviny v zločinu, dá se pomocí ní určit otcovství a podobně. V zemědělství představují DNA technologie celou plejádu nových možností včetně různých geneticky modifikovaných plodin.[27]