Fluorescence

Intenzita fluorescence je sledování změny celkového světelného výkonu. To se následně používá ke kvantifikaci biochemické reakce. Tento typ sledování je často využíván v enzymatických testech (např. proteázách, lipázách). Existují dvě varianty - fluorogenní testy a testy fluorescenčního zhášení. V testech fluorescenčního zhášení je fluorescenční skupina kovalentně navázána na substrát. Po štěpení se uvolní fluorescenční skupina, což vede ke zvýšení intenzity fluorescence.[4]

Fluorescenční excitační spektrum charakterizuje elektronovou distribuci molekuly v základním stavu. Excitace je ekvivalentní absorpci, protože po absorpci molekula dosáhne excitovaného stavu Sn. Fluorescenční excitační spektrum se získá fixací emisní vlnové délky a spuštěním excitačního monochromátoru.[5]

Polarizace fluorescence je výkonným nástrojem pro studium molekulárních interakcí sledováním změn ve zjevné velikosti fluorescenčně značeného ligandu. Podobně jako u scintilačních proximitních testů, polarizace umožňuje vědci prohlížet molekulární vazebné události v roztoku, což umožňuje skutečnou rovnovážnou analýzu do nízkého pikomolárního rozsahu. Měření polarizace neovlivňují vzorky, takže je lze zpracovat a znovu analyzovat, aby se zjistil vliv na vazbu takovými změnami, jako je pH, teplota a koncentrace solí. Teorie polarizace fluorescence je založena na pozorování, že když je malá fluorescenční molekula excitována rovinně polarizovaným světlem, je emitované světlo do značné míry depolarizováno, protože molekuly se během své fluorescenční životnosti rychle přeskupují v roztoku.[6]

Existuje třída fluorochromů, které jsou určeny k měření změn v intracelulárním prostředí, souhrnně známé jako poměrové barvy. Tato barviva, jako je fura, BCECF a beta-laktamáza, jsou fluorochromy s duální excitací nebo duální emisí, které mají vícenásobné absorpční (excitační) / emisní charakteristiky. Aby se přesně změřily změny fluorescence, je často vyžadováno použití filtračních kol, protože přepínání mezi jednopásmovými filtračními soupravami by znamenalo riziko posunutí vzorku a následného nesprávného vyrovnání finálních obrazů.

FRET je jev, kdy „excitovaná“ donorová fluoroforová molekula přenáší energii v neradiačním procesu na vhodnou akceptorovou fluoroforovou molekulu. Tento přenos energie se nazývá „neradiační“, protože k němu dochází bez emise fotonu z fluoroforu dárce. Místo toho zahrnuje přímý přenos energie donorové molekuly v excitovaném stavu, když se její fluorescenční emisní spektrum překrývá s excitačním spektrem akceptorového fluoroforu. Výsledný signál FRET z akceptoru je často označován jako „senzitizovaná emise“.

TIRF je technika, která byla vyvinuta k omezení fluorescence na pozadí a ke zvýšení poměru signál k šumu ve výsledných obrazech. Toho je dosaženo v TIRF pomocí schopnosti světla vytvářet evanescentní vlnu (nebo pole) ve velmi omezeném rozsahu ve vzorku za rozhraní dvou substrátů lišících se indexem lomu. [7]

průtoková cytometrie umožňuje na základě značení pomocí fluorescenčních značek identifikovat, analyzovat a případně třídit buněčné subpopulace v suspenzi.