Sekvenování nové generace

Používá se mnoho metod, které však mají některé kroky velmi podobné:

Studovaná DNA je fragmentována na úseky dlouhé několik set bází. Tyto jsou dále napojeny k adaptérům (oligonukleotidy určité sekvence).

Jednotlivé fragmenty jsou odděleně namnoženy reakcí PCR a v dalším kroku paralelně sekvenovány. V naprosté většině se jeho princip neliší od pyroskevenování.[2] Jediným rozdílem je, že pyrosekvenční reakce probíhají paralelně na mnoha fragmentech DNA najednou. Dochází tak k sekvenováni tisíců až milionů vláken DNA současně. Díky takové paralelizaci procesu sekvenování je tak možné osekvenovat celý genom najednou.[3]

Výsledkem je obrovská produkce výstupních dat s následnou potřebou utřídění a analýzy. To představuje další výzvu pro tyto metody, kdy na samotné sekvenování musí navázat pokročilé metody zpracování dat a jejich komprimace.

V některých případech je třeba jisté zjednodušení, zejména s ohledem na výsledné množství dat, které je následně třeba zpracovávat. Proto se někdy nepracuje s celými genomy, ale pouze s některými jeho částmi. Mluví se o tzv. redukované reprezentaci genomu. Této redukované reprezentace lze dosáhnout třemi možnostmi:

• použití restrikčních enzymů (pomocí specifických enzymů dojde k naštípení sekvencí DNA na přesně určených místech a sekvenovány jsou pouze místa do určité vzdálenosti od restrikčního místa (místa štěpení));
• sekvenování RNA (není sekvenován celý genom, ale jen ty části, které jsou překládány do RNA);
• sequence capture (jsou přesně určeny sekvence, které mají být sekvenovány. Může se jednat například o sekvence konkrétních genů, nebo o místa obsahující konkrétní oligonukleotidové sekvence).

454 sekvenování bylo vyvinuto firmou Roche. Využívá kombinaci paralelního pyrosekvenování mnoha tisíců vláken DNA, které byly předtím amplifikovány metodou emulzní PCR. [4] Pomocí sekvence adaptéru jsou fragmenty imobilizovány na speciálních kuličkách, a to tak, že každá kulička nese jeden fragment. Každá jednotlivá kulička je enkapsulovaná (zapouzdřená) do emulze vody v oleji pomocí přídavku emulzního oleje. Zapouzdření jednotlivých kuliček emulzí umožní následnou emulzní PCR. Každá kulička má k dispozici všechny potřebné komponenty pro PCR reakci. PCR reakce v zapouzdřených kuličkách umožňuje amplifikaci jednotlivých molekul DNA. Každá kulička je poté vyjmuta z emulze a zanesena do speciální destičky obsahující řadu pikolitrových reaktorů, v každém z těch reaktorů se tedy nachází namnožené kopie jediného fragmentu DNA a všechny další enzymy potřebné pro proběhnutí pyrosekvenační reakce.[5][6]

V říjnu 2013 Roche oznámilo, že ukončuje podporu platformy 454.[7]

Solexa (dnes také často nazývaná Illumina, podle jména firmy, která platformu později odkoupila) oproti předchozí metodě nevyužívá pyrosekvenování. Sekvenování probíhá detekcí fluorescenčních záblesků nově dosedajícího nukleotidu (každý nukleotid nese jiný fluorofor a tedy vyzáří světlo jiné barvy). Předchozí amplifikace neprobíhá na kuličkách, ale na destičce opatřené oligonukleotidy, na níž se každý segment DNA amplifikuje pomocí můstkové PCR (adaptory opatřené segmenty DNA na obou stranách se uchycují na oligonukleotidy  a vytváří tak můstek mezi jednotlivými oligonukleotidy, který tomuto typu PCR reakce dal název).

Tato metoda, vyvinutá firmou Applied Biosystems, využívá také emulzní PCR reakci probíhající na kuličce. Vzniklé namnožené segmenty jsou umístěné do mikroreaktorů na skleněnou destičku a následně jsou na ně vázány fluorescenčně značené sondy obsahující vždy dva nukleotidy. Dochází k opakované ligaci a odmývání různých sond a je měří se intenzita záblesků při navázání sondy na segment. 

Iont Torrent je metoda firmy Life Technlogies využívající polovodičových čipů k detekci vodíkových kationtů, které se uvolňovány při začlenění nových nukleotidů do vznikajícího vlákna DNA. Do reakčního prostoru se střídavě vpouští různé nukleotidy, pokud dojde k zařazení patřičného nukleotidu, uvolněný vodíkový kationt způsobí změnu pH, kterou je polovodičový detektor schopný zachytit.