Plastidová DNA

Srovnání rozměrů u řasy rodu Chlamydomonas

	buňka: průměr 10 mikrometrů; obvykle obsahuje jeden chloroplast[2]
	chloroplast: průměr několik mikrometrů; obsahuje až 80 molekul chloroplastové DNA[2]
	plastidová DNA: řetězec 203 395 párů bází má délku asi 0,07 milimetru (výpočet dle The Physics Factbook[4])

Plastidy jsou speciální organely, které jsou přítomné v některých eukaryotických buňkách, tedy v buňkách se složitější strukturou a jistou vnitřní hierarchií. Konkrétně se plastidy vyskytují u rostlin (Plantae), dále například u obrněnek (Dinophyta), skrytěnek (Cryptophyta), hnědých řas (Phaeophyceae) či krásnooček (Euglenophyta). Původní funkcí plastidů je fotosyntéza, ačkoliv u některých organizmů jsou známy i plastidy neschopné fotosyntetizovat. Plastidy jsou od zbytku buňky odděleny několika membránami a tvoří tak samostatný „kompartment“. To, že navíc obsahují vlastní genom – tedy plastidovou DNA – naznačuje, že plastidy jsou do určité míry nezávislou jednotkou (označujeme je jako semiautonomní organely). DNA, čili deoxyribonukleová kyselina, je totiž přítomna ve všech buněčných organizmech, kde slouží jako genetický materiál, v němž jsou zapsány ve formě genetického kódu návody na výrobu všech bílkovin v buňce. Skutečnost, že i plastidy mají vlastní genom, ačkoliv nejsou samostatné organizmy, je tedy zdánlivě paradoxní. Mnohé studie však prokázaly, že plastid je zřejmě potomkem sinic,[5][6] které se kdysi dostaly do eukaryotické buňky a zdomácněly v ní, a že genom plastidů má s genomem sinic mnoho společných rysů.

V řase Chlamydomonas byla poprvé dokázána přítomnost plastidové DNA
(zvětšení: 10 000×, rastrovací elektronový mikroskop)

Úvahy o existenci mimojaderné dědičnosti v plastidech se objevovaly již v padesátých letech 20. století, ale pokusy o izolaci DNA byly neúspěšné. Úspěšně byla vlákna plastidové DNA dokázána až v roce 1962 Hansem Risem a Walterem Plautem z University of Wisconsin v jejich studii Ultrastructure of DNA-containing areas in the chloroplast of Chlamydomonas, a to v chloroplastech jednobuněčné řasy rodu Chlamydomonas.[1] V této studii již byla zmíněna hypotéza, že chloroplasty mohou být potomky prokaryotických endosymbiontů.[7] O rok později následovaly v rychlém sledu zprávy o izolaci plastidové DNA z nejrůznějších rostlin.[1] Dalším úspěchem vědy byla sekvenace kompletního chloroplastového genomu. Poprvé se tak stalo u porostnice mnohotvárné (Marchantia polymorpha)[8] Dodnes pak bylo osekvenováno více než 150 plastomů (genomů v plastidech).[9]

Chloroplastová DNA má některé vlastnosti, které usnadňují její využití k různým molekulárně biologickým studiím. Tento genom je totiž poměrně malý, přítomný v mnoha kopiích a poměrně dobře prostudovaný. Navíc poměrně pomalu mutuje a má mnoho zvláštností, které činí jeho výzkum zajímavý například pro evoluční či molekulární biology.[10]

Sekvenace DNA z plastidů dnes pomáhá vědcům odhalovat například evoluci eukaryotických organizmů, zejména těch s plastidem. Na základě těchto sekvencí se například zjišťuje, kolik sekundárních endosymbióz proběhlo v evolučním stromu eukaryot, jak probíhá genový transfer z organely do jádra či jaké jsou vývojové vztahy mezi různými skupinami eukaryot.[11] Mnohé studie využívají drobných rozdílů mezi pDNA jednotlivých druhů téhož rodu za účelem zjištění přesných příbuzenských vztahů mezi těmito druhy.[12] Rovněž se s ním pracuje při zjišťování migrací jednotlivých druhů rostlin, například údaje o rekolonizaci Evropy dubem (Quercus) po skončení doby ledové pramení právě zejména z výzkumu jejich cpDNA. Srovnáváním sekvencí plastidové DNA evropských dubů je možné zjistit, jaké populace jsou vzájemně příbuzné a pochází tedy pravděpodobně z jednoho místa.[13]

S výjimkou nukleomorfu, který je odlišného původu než běžná plastidová DNA, má řetězec pDNA zřejmě tvar uzavřené smyčky a označuje se tedy tradičně jako kruhový, podobně jako u většiny prokaryotických organizmů.[2] Některé současnější studie však podtrhují skutečnost, že plastidová DNA je o poznání komplikovanější struktura, která svoji stavbu mění v čase a cirkulární typ se objevuje spíše vzácněji.[14][15] U kukuřice byly dokonce pozorovány lineární, složitě větvené chromozomy a zastoupení kruhových molekul činilo pouze 3–4 %.[16] Jisté je však to, že pDNA má u různých druhů rozmanitou velikost a různý je i počet genů, které kóduje.

Množství plastidové DNA přítomné v buňce samozřejmě v první řadě závisí na počtu plastidů v buňce, ale dále pak také na počtu samotných molekul DNA v jednom plastidu a za třetí na velikosti plastidové DNA. Řasa Chlamydomonas má jen jeden chloroplast, avšak ten obsahuje až 80 molekul DNA. Listy kukuřice obsahují v každé buňce 20–40 chloroplastů, každý chloroplast obsahuje ale 20–40 molekul DNA. U kukuřice tvoří plastidová DNA 15 % celkového genomu v buňce, u řasy Chlamydomonas jen 7 %.[17]

Struktura a geny

Obecné schéma chloroplastové DNA: SSC (small single copy), dva regiony inverted repeats a LSC (large single copy)

Kruhový plastidový genom (zejména u rostlin) má poměrně stabilní strukturu, u níž se dají vysledovat některé zákonitosti. Například chloroplastová DNA tabáku (Nicotiana) a játrovky (Marchantiophyta) je téměř stejná.[2] Obvykle se na ní rozlišují dvě oblasti, jejichž sekvence jsou obsažené v cpDNa vždy jen jednou –tzv. large single copy (LSC) a small single copy (SSC). Mezi nimi se nachází dvě oblasti, které obsahují tutéž sekvenci, ale s obráceným pořadím komplementárních bází. Tato část se označuje jako inverted repeat (IR), vyskytuje se u téměř všech rostlin a kóduje například geny pro ribozomální RNA. I když jsou geny kódované v IR u různých druhů odlišné, v rámci jedné kruhové molekuly jsou vždy obě sekvence zmíněného regionu až na směr zcela shodné a není znám mechanismus, který to způsobuje.[24] Tento region zřejmě stabilizuje DNA před výraznějšími strukturními změnami. Inverted repeat přesto zcela chybí u zástupců čeledi bobovitých (Fabaceae) a u některých jehličnanů (borovice, douglaska).[25] Je zřejmé, že plastidová DNA v různých liniích fotosyntetizujících organizmů prochází značnými strukturními změnami a někdy se značně odlišuje od zmiňovaného modelu. U některých obrněnek (Dinoflagellata) je například plastom zřejmě rozdělen do množství drobných kruhových molekul o délce jen asi 2–3 tisíce párů bází. Každý kruh obsahuje obvykle jeden gen, někdy však dva nebo také vůbec žádný.[26]

Rovněž počet plně funkčních (přepisovaných a translatových) genů je velice rozmanitý. Řádově obsahuje jedna molekula pDNA několik desítek či stovek genů, chloroplasty vyšších rostlin obvykle kolem 120 genů.[2] Tyto geny kódují čtyři molekuly ribozomální RNA a 20 ribozomálních proteinů (podílející se na stavbě ribozomů v chloroplastech), asi 30 různých transferových RNA, dále několik podjednotek chloroplastové RNA polymerázy, několik součástí fotosystémů I a II a ATP syntázy účastnící se fotosyntézy v chloroplastech, několik enzymů elektronového transportního řetězce, jednu podjednotku enzymu RuBisCO a další proteiny, některé s neznámou funkcí.[2] Z tohoto přehledu je poměrně zřejmé, že chloroplast není soběstačný a všechny jeho ostatní součásti, namátkou například malé podjednotky enzymu RuBisCO,[27] jsou transportovány z vnějšku z cytoplazmy. K této situaciu přispěl proces horizontálního transferu DNA z pDNA do jaderné DNA (viz níže).

Na druhou stranu je známo, že plastidová DNA uvnitř některých svých genů obsahuje i nekódující oblasti, tzv. introny, které jsou typické pro eukaryota. Introny jsou z čerstvě vytvořené mRNA odstraňovány díky procesu splicingu.[2]

Ribozom v chloroplastech slouží k translaci RNA, která vznikla přepisem pDNA

Na transkripci plastidové DNA se podílí dvě RNA polymerázy. První, složená z více jednotek, je kódovaná z velké části (vyjma podjednotky sigma) geny přítomnými v pDNA. Proto se anglicky označuje tato polymeráza jako plastid-encoded RNA polymerase čili PEP. PEP je velice podobná RNA polymerázám bakterií, zejména sinic. Druhá RNA polymeráza v chloroplastu se skládá pouze z jedné podjednotky a je kódovaná geny v samotném buněčném jádře (tzv. nucleus-encoded RNA polymerase, NEP). U organizmů s plastidy, které již ztratily svou fotosyntetickou funkci (např. mnohé parazitické rostliny), dochází obvykle ke ztrátě genů pro RNA polymerázu.[28]

K translaci (syntéze proteinů) dochází na ribozomech prokaryotického typu přímo uvnitř v plastidech. Tyto ribozomy jsou velice podobné ribozomům bakterií svou stavbou i citlivostí k antibiotikům. Syntéza proteinů začíná v chloroplastech translací N-formylmethioninu, zatímco pro eukaryota je typický methionin.[2] Genová exprese, tzn. vlastně míra syntézy určitých proteinů, je kontrolována zejména mírou translace na ribozomech, a je poněkud komplikovanější než u prokaryot. Je tak umožněna koordinace syntézy proteinů v jádře a plastidu.[29]

K replikaci genomu v plastidech dochází obvykle zcela průběžně, nezávisle na fázi buněčného cyklu, v níž se eukaryotická buňka nachází. Některý řetězec se tak zřejmě v určitém období zreplikuje i několikrát, zatímco jiná kopie vůbec. Přesto k určité regulaci replikace dochází.[2] Ústřední roli v něm zřejmě hrají plastidové DNA polymerázy, označované v některých studiích jako Os-PolI-like (Os je zkratka pro rostlinu Oryza sativa, z níž byl enzym izolován). Tyto jsou kódované jaderným genomem a vykazující značnou podobnost s polymerázou I sinic.[30] Samotný průběh replikace je zřejmě poměrně odlišný od replikace jaderné DNA, už jen z důvodu, že pDNA je obvykle popisována jako kruhová. Replikace začíná v typickém případě na dvou místech vzdálených 7000 párů bází, tedy v každém vláknu na jednom místě. DNA polymerázy na obou vláknech tvoří charakteristické D-loops, které se k sobě přibližují, nakonec splývají, ale každá DNA polymeráza pokračuje svým směrem, čímž postupně vzniká kruhová molekula, z níž na jedné straně vyhřezává dceřiný půlkruhovitý řetězec.[31]

Na tomto fylogenetickém stromu eukaryot je zachycena jedna z představ, jak vznikaly plastidy. Modrá šipka od bakterií ke skupině Archaeplastida znázorňuje primární endosymbiózu, zbylé dva červené proužky znázorňují endosymbiózu sekundární
(představa o vzniku plastidů dle[32], aktualizace systému dle[33])

Plastidy a jejich DNA, která vykazuje nápadnou podobnost s DNA prokaryot, podobně jako mitochondriální DNA, jsou dokladem endosymbiotické teorie.[6] Na rozdíl od mitochondrií se plastidy vyvinuly u několika, často nepříbuzných skupin eukaryot.

Tzv. primární plastidy však pochází ze sinic a vznikly pravděpodobně pouze jednou, a to u rostlin, které v širším pojetí zahrnují nejen zelené rostliny (Viridiplantae), ale i ruduchy (Rhodophyta) a glaukofyty (Glaucophyta).[34] Plastidy u jiných druhů fotosyntetizujících eukaryot vznikly především sekundární endosymbiózou, tedy pohlcením jedné ze skupin rostlin. Pohlcením ruduchy vznikly plastidy (někdy kvůli svému původu zvané rhodoplasty) např. u různých heterokont (Heterokonta) a rozsivek (Bacillariophyceae), pohlcením zelené řasy vznikly plastidy u Chlorarachniophyta, některých krásnooček (Euglenozoa) a jedné obrněnky (Dinoflagellata).[6]

Dnešní pDNA kóduje jen asi 5–10 % původních genů svých sinicových předků. To je způsobeno buď ztrátou některých genů, které nebyly potřebné, nebo jejich přenosem do jádra.[11] V druhém případě se jedná o proces tzv. horizontálního přenosu genetické informace, díky němuž je množství genů prapůvodně pocházejících z plastidu (a ještě dříve z genomu sinic) dnes již začleněno do jaderné DNA.[2] Bylo zjištěno, že v jaderné DNA huseníčku rolního (Arabidopsis thaliana) je přítomno až 4 500 genů, které pochází ze sinic, z nichž vznikly plastidy. To tvoří 18 % z celkového počtu genů huseníčku. Dále se uvádí, že množství genů dnes přítomných v jaderné DNA této rostliny se u některých jiných skupin organizmů stále vyskytuje v jejich chloroplastové DNA.[11]

V souvislosti s horizontálním transferem je možno uvést, že neprobíhá jen výměna genomu mezi plastidem a jádrem, ale i mezi plastidem a mitochondrií. Přenos opačným směrem, tzn. z vnějšího prostředí do plastidu, je zřejmě jev vzácnější, ačkoliv i tento případ byl zaznamenán. V tom případě se obvykle do plastidové DNA začleňuje sekvence genů některých bakteriofágů (jev rovněž zvaný transdukce) nebo např. sekvence parazitické bakterie Agrobacterium tumefaciens.[35]

Dědičnost pDNA při pohlavním rozmnožování souvisí se způsobem přenosu semiautonomních organel z pohlavních buněk do vznikající zygoty. Asi u dvou třetin vyšších rostlin se pDNA přenáší pouze ze samičích pohlavních buněk (maternálně, samčí chloroplasty z pylových zrn tedy nevstupují do zygoty). U zbytku vyšších rostlin je v zygotě přítomna kombinace samčích i samičích chloroplastů a dědičnost pDNA je tedy biparentální.[2] Dá se říci, že maternální dědičnost projevuje většina krytosemenných (ačkoliv některé jsou také biparentální). Zejména u některých nahosemenných však byla objevena výhradně paternální dědičnost, tzn. že všechna plastidová DNA v potomstvu pochází z pylového zrna. Mechanismy odstranění plastidů jednoho pohlaví jsou obvykle komplikovaná a mohou působit před nebo po oplození.[36]

Když určitá rostlina s biparentální dědičností plastidů zdědí od jednoho z rodičů defektní plastid (tzn. defekt způsobený urč. mutacemi v pDNA), je někdy možné pozorovat na listech mozaikovitou zeleno-bílou strukturu, neboť určité části pletiv jsou schopné fotosyntetizovat a jiné nikoliv. Tento jev je označován variegace.[2]