DNA polymeráza
DNA polymerázy sú enzýmy schopné syntetizovať nové vlákno DNA na základe predlohy vo forme komplementárneho vlákna. Ich rola v bunke spočíva v replikácii DNA. Existuje niekoľko prokaryotických a eukaryotických DNA polymeráz, ktoré sa navzájom odlišujú presnosťou replikácie, schopnosťou opravovať spôsobené chyby a schopnosťou odbúravať vlákno na 5' konci DNA. Ich spoločnou vlastnosťou, ktorá je daná ich funkciou, je schopnosť pripájať deoxyribonukleotid monofosfáty (dNMP) k 3'-OH koncu syntetizovaného reťazca. Spôsobujú tak polymeráciu jedného vlákna DNA v smere od 5' konca ku 3' koncu, hovorí sa teda, že majú 5'-3' polymerázovú aktivitu [1].
Dodatočná funkcia väčšiny DNA polymeráz je 3'-5'-exonukleázová aktivita, vďaka ktorej sa môže polymeráza "vrátiť" a odbúrať práve syntetizovanú dvojicu nukleotidov. Táto aktivita je dôležitá pre minimalizáciu nepresností pri replikácii DNA. Ďalšou dodatočnou, ale skôr vzácnou funkciou, je 5'-3' exonukleázová aktivita, vďaka ktorej môžu niektoré DNA polymerázy odbúravať primery a DNA opravovať.[1]
Podobne, ako iné enzýmy interagujúce s DNA, potrebuje DNA polymeráza pre svoju aktivitu horečnaté katióny Mg+, ktoré stabilizujú záporne nabité fosfátové skupiny DNA. Monoméry DNA sa reakcie polymerácie zúčastňujú ako deoxyribonukleotid trifosfáty a energia pre tvorbu fosfodiesterovej väzby medzi fosfátom a voľnou 3'-OH skupinou syntetizovaného vlákna je dodaná rozštiepením začleňovaného deoxynukleotid trifosfátu na deoxynukleotid monofosfát a pyrofosfát.[1]
Prokaryotické DNA polymerázy
Bakteriálne DNA polymerázy sa označujú rímskymi číslicami.
| Polymeráza | Štruktúrny gén | Podjednotky | Molekulová hmotnosť v Daltonoch | 3'-5' exonukleázová aktivita | 5'-3' exonukleázová aktivita | Rýchlosť polymerizácie (nukleotidov/s) | Procesivita (počet pridaných nukleotidov pred disociáciou) |
| DNA polymeráza I | polA | 1 | 103 000 | áno | áno | 10-20 | 3-200 |
| DNA polymeráza II | polB | 7 | 88 000 | áno | nie | 40 | 1500 |
| DNA polymeráza III | polC (dnaE) | 10 a viac | 791 500 | áno | nie | 250-1 000 | nad 500 000 |
DNA polymeráza I
DNA polymeráza I je prvou DNA polymerázou izolovanou z bakteriálneho kmeňa E. coli. Už krátko po jej objave vyšlo najavo, že nie je vhodná pre replikáciu celého genómu E. coli - jej nameraná rýchlosť je 100x pomalšia ako rýchlosť pohybu replikačnej vidličky a má veľmi nízku procesivitu (schopnosť vykonávať činnosť nepretržite). Na rozdiel od ostatných polymeráz však má 5'-3' exonukleázovú aktivitu, vďaka ktorej môže odbúravať nukleotidy (či už DNA alebo RNA vlákna), ktoré by inak bránili polymeráze v pohybe v smere od 5' konca ku 3' koncu syntetizovaného vlákna. Vďaka tejto schopnosti hrá DNA polymeráza I rolu v odbúravaní primerov, rekombinácii a pri oprave DNA. 5'-3' exonukleázovú aktivitu zabezpečuje malý fragment, ktorý je možné od zvyšku enzýmu oddeliť miernou proteolýzou. Zvyšok enzýmu (tzv. veľký alebo Klenowov fragment) si v takom prípade zachováva 5'-3' polymerázovú a 3'-5' exonukleázovú aktivitu.[1]
DNA polymeráza II
DNA polymeráza II na rozdiel od DNA polymerázy I nemá 5'-3' exonukleázovú aktivitu. Skladá sa až zo siedmich podjednotiek, DNA syntetizuje približne 2x rýchlejšie a má tiež niekoľkonásobne vyššiu procesivitu. Napriek tomu však jej vlastnosti nie sú dostatočné pre replikáciu celého genómu baktérie.[1]
DNA polymeráza III
DNA polymeráza III je hlavná DNA polymeráza v E. coli. Podobne, ako DNA polymeráze II, jej chýba 5'-3' exonukleázová aktivita, jej rýchlosť je však asi 100x vyššia ako rýchlosť DNA polymerázy I. Za jednu sekundu teda pripojí k jednému vláknu 250-1 000 nukleotidfosfátov. Skladá sa z 13 podjednotiek označovaných gréckymi písmenami - α podjednotka zodpovedá za polymeráciu a ε podjednotka za 3'-5' exonukleázovú aktivitu. Zvyšné jednotky tvoria telo enzýmu, pričom dôležité sú β podjednotky, ktoré fungujú ako zverák a zabezpečujú, aby sa komplex neoddisocioval od vlákna DNA, čiže vysokú procesivitu.[1][2]
Eukaryotické DNA polymerázy
Eukaryotické DNA polymerázy sú štruktúrne a funkčne podobné polymerázam prokaryotickým. Skladajú sa z viacerých podjednotiek a označujú sa gréckymi písmenami.[1]
DNA polymeráza α
DNA polymeráza α svojou funkciou vybočuje z rady ostatných DNA polymeráz. Nemá 3'-5' exonukleázovú aktivitu a pravdepodobne hrá rolu len v syntéze krátkych primerov, či už z RNA alebo z DNA, tvoriacich Okazakiho fragmenty.[1]
DNA polymeráza β
DNA polymeráza β hrá rolu predovšetkým pri oprave DNA, konkrétne v miestach, na ktorých boli nukleotidové báze chemicky modifikované (oxidáciou, metyláciou a pod.).[1]
DNA polymeráza γ
DNA polymeráza γ je živočíšna DNA polymeráza, ktorá slúži exkluzívne na replikáciu DNA v mitochonriách, v ktorých hrá rolu aj v oprave DNA a v jej rekombinácii.[3]
DNA polymeráza δ
DNA polymeráza δ je hlavnou eukaryotickou polymerázou. Asociuje s proteínom PCNA (z angl. proliferating cell nuclear antigen), ktorý je štruktúrne veľmi podobný β podjednotke bakteriálnej DNA polymerázy III a tak aj funguje - výrazne zlepšuje procesivitu DNA polymerázy δ. DNA polymeráza δ má schopnosť 3'-5' exonukleázovej aktivity a pri replikácii sa podieľa na syntéze vedúceho aj oneskorujúceho sa vlákna.[1]
DNA polymeráza ε
DNA polymeráza ε v niektorých prípadoch nahradzuje DNA polymerázu δ, predovšetkým pri oprave DNA a pravdepodobne aj pri 5'-3' exonukleázovej aktivite, pri ktorej odbúrava primery (podobne ako prokaryotická DNA polymeráza I).[1]
Reverzná transkriptáza
Reverzná transkriptáza je RNA závislá DNA polymeráza, syntetizuje nové vlákno DNA komplementárne k existujúcemu vláknu RNA. Navyše má schopnosť odbúravať RNA vlákno, ktoré je komplementárne spárované k DNA vláknu. Reverznú transkriptázu využívajú retrovírusy na prepis svojej RNA do DNA, ktorú následne začleňujú do genómu hostiteľskej bunky. Ide napríklad o vírus hepatitídy B alebo HIV.
Využitie vo výskume
DNA polymeráza je jeden z najdôležitejších enzýmov, ktoré sú vedecky využívané pri práci s DNA, konkrétne pre jej amplifikáciu, klonovanie a sekvenáciu. Pre účely molekulárnej biológie boli izolované termostabilné DNA polymerázy, predovšetkým z bakteriálnych a archeálnych organizmov žijúcich v morských hlbinách. Tieto DNA boli pre vedecké účely ďalej modifikované mutáciami, aby bola ich aktivita zlepšená v prospech daného účelu. Doposiaľ najväčšie využite nachádzajú DNA polymerázy v tzv. polymerázovej reťazovej reakcii, vďaka ktorej môžu vedci amplifikovať z jednej molekuly templátovej DNA ľubovoľný úsek DNA.[1]
Referencie
- NELSON, David L.; COX, Michael M.. Lehninger Principles of Biochemistry. 6. vyd. New York : W. H. Freeman and Company, 2013. ISBN 978-1-4641-0962-1. (anglicky)
- KOLEKTÍV AUTOROV. Biochemie - Základní kurz. 3. vyd. Praha : Učební texty Univerzity Karlovy v Praze, 2000. (česky)
- KAGUNI, L. S.. DNA polymerase gamma, the mitochondrial replicase. Annual review of biochemistry, 2004, s. 293-320. (anglicky)
