Polymerázová reťazová reakcia
Polymerázová reťazová reakcia (PCR, z angl. polymerase chain reaction) je technika, ktorá umožňuje namnožiť určitý úsek molekuly DNA. Jej koncept vytvoril biochemik Kary Mullis v roku 1983, za čo bol v roku 1993 odmenený Nobelovou cenou za chémiu. Objav PCR významne prispel k rozvoju molekulárneho klonovania a výskumu proteínov a otvoril možnosť sekvenovať DNA. V medicíne sa používa na diagnostiku dedičných ochorení a detekciu infekčných chorôb, vo forenznej genetike na identifikáciu podľa DNA a tiež na určovanie otcovstva.[1]
Princíp
Princíp PCR je založený na činnosti DNA polymerázy, ktorá amplifikuje (množí) vlákno DNA v smere 5'-3'. DNA polymeráza však nedokáže syntetizovať nové vlákno DNA od začiatku, potrebuje na to tzv. primer, čo je krátky úsek DNA, ktorý je presne komplementárny s vláknom DNA, ktoré je potrebné amplifikovať (tzv. templátové vlákno alebo templát [2]; porovnaj s replikáciou, pri ktorej bunka používa ako primer RNA [3].). Pre PCR sú teda potrebné dva primery (pre amplifikáciu oboch vláken dvojvláknového DNA) a je potrebné poznať sekvenciu okrajových častí amplifikovaného úseku DNA, aby bolo podľa nej možné navrhnúť a syntetizovať primery. Tie sú v praxi dlhé okolo 18 párov nukleových báz. Ich presná dĺžka sa určuje tak, aby na amplifikovanú DNA (templát) nasadali pri teplote typicky okolo 60 °C (nad touto teplotou primery disociujú). Táto teplota sa nazýva nasadacia teplota (z angl. annealing temperature) a je možné ju vypočítať pomocou prediktorou, z ktorých mnohé sú zadarmo dostupné na internete. Samotná polymerácia DNA polymerázami následne prebieha pri zvýšenej teplote (typicky 72 °C), preto sú pre tieto účely vyuzívané polymerázy izolované z organizmov žijúcich v extrémnych tepelných podmienkach a deriváty týchto polymeráz. Tento cyklus sa opakuje typicky 20 – 40-krát, pričom s každým cyklom rastie množstvo reťazcov DNA exponenciálne. Na začiatku každého cyklu sa navyše reakčná zmes zohrieva na vysokú teplotu (okolo 96 °C), vďaka čomu sa vlákna templátového DNA od seba oddelia a sú v nasledujúcich krokoch prístupné ako primerom, tak aj polymeráze.[1]
DNA polymeráza
Pre PCR sa dnes používajú geneticky upravené termostabilné DNA polymerázy, pôvodne izolované z organizmov žijúcich v extrémnych podmienkach. Prvá takáto polymeráza, ktorej geneticky upravené verzie sú dodnes používané, bola Taq polymeráza, izolovaná z Thermus aquaticus v Yellowstonskom národnom parku študentkou A. Chien ako súčasť jej diplomovej práce. Ďalšie komerčne bežne dostupné DNA polymerázy sú Pfu polymeráza (izolovaná z Pyrococcus furiosus), Deep Vent a Vent polymerázy (názvy naznačujú, že boli izolované z organizmov žijúcich pri hlbokomorských prieduchoch) a mnoho ďalších. Polymerázy z triedy A nemajú 3'-5' exonukleázovú aktivitu a chýba im tak schopnosť opravovať chyby – ich chybovosť je väčšia a pri ich použití je väčšia pravdepodobnosť vzniku mutácie. Polymerázy typu B na druhej strane 3'-5' exonukleázovú aktivitu majú a ich chybovosť je menšia (majú teda vyššiu tzv. fidelitu).[4]
Primery
Syntéza oligonukleotidov je dnes plne automatizovaný proces. Na syntézu sa používajú deriváty deoxyribonukleotidov a ribonukleotidov, ktoré majú chránené reakčné skupiny, ktoré reagovať nemajú. Syntéza prebieha väčšinou v smere 3'-5' a 3'-koncová aminokyselina je kovalentne spojená s pevnou fázou, ktorou sú typicky porézne sklo alebo makroporézny polystyrén.[5].
Reakčný roztok
PCR prebieha vo vodnom roztoku. Jeho nenahraditeľnou súčasťou sú horečnaté katióny Mg2+ typicky v koncentrácii 0,5 – 5,0 mM, ktoré sú potrebné pre aktivitu DNA polymerázy. Ďalším typickým katiónom je katión draselný (35 – 100 mM). Súčasťou roztoku často bývajú detergenty, typicky dimetylsulfoxid (DMSO), ktoré rozplietajú dvojzávitnicu DNA, zvyšujú tak nasadaciu teplotu primerov a zvyšujú reakčný výťažok. DMSO sa pridáva do PCR predovšetkým ak primery obsahujú zvýšený podiel GC párov nukleových báz.[6]
Procedúra
Typická polymerázová reťazová reakcia môže vyzerať nasledovne:
1. Iniciácia (10 min, 96 °C) – predohriatie reakčnej zmesi na 94 – 98 °C – Krok je potrebný pri použití konkrétnych DNA polymeráz, ktoré sú extrémne termostabilné a týmto krokom sú aktivované.
2a. Denaturácia (30 s, 96 °C) – počiatočný krok cyklu. Reakčná zmes je zohriata na vysokú teplotu, pri ktorej disociujú dve vlákna dvojšróbovice DNA.
2b. Nasadanie (30s, 60 °C) – nasadanie primerov.
2c. Polymerácia (1 min, 72 °C) – DNA polymeráza syntetizuje novú DNA v smere 5' – 3': nasadá na primery a ďalej syntetizuje podľa templátovéj DNA.
Kroky 2a – 2c sa cyklicky opakujú 20 – 40-krát.
3. Elongácia (10 min, 72 °C) – čas a teplota, pri ktorej má DNA polymeráza možnosť dosyntetizovať prípadné nedosyntetizované jednovláknové úseky DNA.
4. Ukončenie (4 °C) – reakčná zmes sa na konci PCR reakcie schladí a pri 4 °C môže byť krátku dobu skladovaná.
Po ukončení PCR sú jej produkty typicky izolované a ich správna veľkosť je overovaná pomocou agarózovej elektroforézy. [7]
Obmeny PCR
RT-PCR
RT-PCR, čiže polymerázová reťazová reakcia s reverznou transkripciu, je obmena PCR, pri ktorej je najprv s použitím reverznej transkriptázy prepísaná izolovaná RNA do cDNA (čiže komplementárnej DNA) a tá je následne templátom pre PCR reakciu, ktorá danú cDNA namnoží. Táto metóda sa využíva pri výskume RNA, konkrétne pri určovaní, aká RNA sa v bunke nachádza. RNA je výhodné prepísať do DNA a následne pracovať s DNA, pretože DNA je omnoho stabilnejšia.
qPCR
Kvantitatívna PCR (qPRC), alebo aj PCR v reálnom čase (RT-PCR, z angl. real-time PCR) je metóda, pomocou ktorej je možné presne stanoviť množstvo DNA alebo RNA (v prípade RNA je kombinovaná s PCR s reverznou transkripciou). Princíp je založený na tom, že do reakčnej zmesi sa pridáva fluorescenčné farbivo, ktoré fluoreskuje po naviazaní len na dvojvláknové DNA. Prístroje pre qPCR, na rozdiel od klasických PCR prístrojov, sú schopné merať fluorescenciu reakčnej zmesi po prebehnutí každého cyklu. S každým cyklom je tak možné pozorovať nárast signálu. Čim je väčšie množstvo templátového DNA vo vzorke, tým skôr (pri nižšom cykle) signál prekračuje arbitrárne stanovenú prahovú hodnotu. qPCR sa vo výskume používa na kvantifikáciu génovej expresie konkrétnych génov, využitie má tiež v diagnostike a priemysle.
Referencie
- Polymerase Chain Reaction (PCR) [online]. 26.9.2014. Dostupné online.
- VALONES, A.A.V.. Principles and applications of polymerase chain reaction in medical diagnostic fields: a review.. Braz J Microbiol., 2009, s. 1-11. (anglicky)
- NELSON, David L.; COX, Michael M.. Lehninger Principles of Biochemistry. 6. vyd. New York : W. H. Freeman and Company, 2013. ISBN 978-1-4641-0962-1. (anglicky)
- CLINE, J.. PCR fidelity of Pfu DNA polymerase and other thermostable DNA polymerases.. Nucleic Acids Research, 1996, s. 3546 – 51. (anglicky)
- MCMURRY, John. Organická chemie. 6. vyd. Praha : Nakladatelství VŠChT, 2007. ISBN 9978-80-7080-637-1 Chybné ISBN. (česky)
- VARADAJAN, K.. Denaturants or cosolvents improve the specificity of PCR amplification of a G + C-rich DNA using genetically engineered DNA polymerases.. Gene, 1994, s. 1 – 5. DOI: 10.1016/0378-1119(94)90723-4. (anglicky)
- LORENZ, T.C.. PPolymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies.. J. Vis. Exp., 2012. DOI: 10.3791/3998. (anglicky)
