Lipidový raft

Prostorový model sfingomyelinu (a) a cholesterolu (b)

Jedním z klíčových rozdílů mezi lipidovými rafty a plazmatickou membránou, z které jsou rafty odvozeny, je jejich lipidové složení. Lipidové rafty obvykle obsahují 3 až 5násobné množství cholesterolu než okolní dvojvrstva. Jsou také obohaceny o sfingolipidy, jako je například sfingomyelin, kterého je zde typicky o 50 % více než v plazmatické membráně. Aby byl vykompenzován zvýšený obsah sfingolipidů, mají lipidové rafty snížený obsah fosfatidylcholinu, což vede k přítomnosti podobného množství lipidů obsahujících cholin v raftech a v okolní plazmatické membráně. Se sfingolipidy přednostně interaguje cholesterol, a to díky jejich struktuře a nasycenosti uhlovodíkových řetězců. Ačkoli ne všechny fosfolipidy v raftech jsou zcela nasycené, hydrofobní řetězce lipidů obsažených v raftech jsou více nasycené a pevněji uspořádané než lipidy v okolní dvojvrstvě.[4] Cholesterol v raftech funguje jako dynamické "lepidlo", a drží je tak pohromadě.[3] V lipidových raftech se cholesterol převážně nachází díky rigidnímu charakteru jeho sterolové skupiny, která zapadá mezi rovné nasycené acylové řetězce lipidů.[4] Důležitou vlastností membránových lipidů je jejich amfipatický charakter. Amfipatické lipidy mají polární hydrofilní skupinu a nepolární hydrofobní oblast.[6] Obrázek vpravo ukazuje tvar sfingomyelinu (převrácený kužel) a cholesterolu (kužel) a jejich hydrofobní a hydrofilní oblasti. Cholesterol má schopnost vmezeřit se mezi lipidy v raftu, a slouží tak jako molekulární vložka a vyplňuje prázdná místa mezi asociovanými sfingolipidy.[7]

Rietveld a Simons dali lipidové rafty v modelových membránách do spojitosti s nemísitelností uspořádané (Lo fáze) a neuspořádané (Ld nebo Lα fáze) tekuté fáze.[8] Příčina této nemísitelnosti je nejistá, ale má se za to, že nemísitelnost minimalizuje volnou energii mezi oběma fázemi.

Lipidové rafty mohou být při nízkých teplotách (např. 4 °C) z okolní plazmatické membrány extrahovány pomocí neiontových detergentů, jako jsou například Triton X-100 a Brij-98. Je-li takový detergent přidán k buňkám, fluidní plazmatická membrána se rozpustí, zatímco lipidové rafty zůstanou nerozpuštěny a mohou být extrahovány.

Lipidové rafty jsou často kvůli jejich složení a rezistenci vůči detergentům také nazývány GEMs (glycolipid-enriched microdomains) nebo DRM (detergent resistant membranes).[9] Nicméně platnost metodiky pracující s rezistencí raftů vůči detergentům byla zpochybněna, a to kvůli nejasnostem ohledně lipidů a proteinů a pozorování, že jsou schopné vyvolávat vznik pevných struktur tam, kde předtím nebyly.[10]

Až do roku 1982 bylo v souladu se Singer-Nicolsonovým modelem tekuté mozaiky, publikovaným v roce 1972, široce přijímáno, že fosfolipidy a membránové proteiny jsou v buněčných membránách náhodně rozmístěny.[4][11] V 70. letech ale Stier & Sackmann a Klausner & Karnovsky s použitím biofyzikálních přístupů postulovali membránové mikrodomény.[12][13] Tyto mikrodomény byly přisouzeny fyzikálním vlastnostem a organizaci lipidových směsí (Stier & Sackmann[12] a Israelachvili et al.[14]). V roce 1974 vedl objev efektů teploty na chování membrány k návrhu "lipidových shluků" v membráně a v roce 1975 data naznačila, že by tyto shluky mohly být kvazikrystalické oblasti obklopené volněji rozptýlenými krystalickými lipidovými molekulami. V roce 1978 vedly rentgenové difrakční studie k dalšímu vývoji tohoto modelu a mikrodomény byly definovány jako "lipidy ve více uspořádaném stavu". V roce 1982 Karnovsky a spolupracovníci formálně stvrdili koncept lipidových domén v membránách. Karnovského výzkum ukázal heterogenitu v délce života 1,6-difenyl-1,3,5-hexatrienu, což indikovalo, že v lipidovém prostředí membrány se nachází několik fází.[4] Jeden typ mikrodomén je tvořen cholesterolem a sfingolipidy. Biltonen, Thompson a jejich spolupracovníci ukázali, že se vytváří díky segregaci těchto lipidů do oddělené fáze.[15] Poté bylo ukázáno, že tyto membrány existují i v buněčných membránách.[16] Později se Kai Simons z Německa a Gerrit van Meer z Nizozemska znovu zaměřili na tyto membránové mikrodomény obohacené o lipidy, cholesterol, glykolipidy a sfingolipidy přítomné v buněčných membránách[17] a následně je pojmenovali jako lipidové rafty. Původní koncept raftů byl využit pro vysvětlení transportu cholesterolu z trans Golgi váčků na plazmatickou membránu, což bylo dále rozvinuto Simonsem a Ikonenovou.[18] V roce 2006 byly na symposiu (Keystone Symposium of Lipid Rafts and Cell Function) lipidové rafty definovány jako "malé (10–200 nm), heterogenní, velmi dynamické, na steroly a sfingolipidy bohaté domény, kompartmentalizující buněčné procesy. Malé rafty mohou být někdy stabilizovány a tvoří větší platformy pomocí protein-proteinových interakcí." V posledních letech se výzkum lipidových raftů snaží odpovědět na klíčové otázky, které vyvolávají kontroverzi v této oblasti a týkají se například velikosti a délky života raftů.[4]

Byly navrženy dva typy lipidových raftů: planární lipidové rafty (také nazývané jako nekaveolární nebo glykolipidové) a kaveoly. Planární rafty jsou definovány tím, že jsou kontinuální s rovinou plazmatické membrány (bez invaginace) a chybí u nich rozpoznávací morfologické znaky. Na druhé straně kaveoly tvoří invaginace plazmatické membrány, tvarem připomínající baňku, obsahují kaveolinové proteiny a jsou to nejsnadněji pozorované struktury v lipidových raftech. Kaveoliny jsou široce exprimovány v cévách v mozku, v endotelových buňkách, astrocytech, oligodendrocytech, Schwannových buňkách, dorsálních kořenových gangliích a neuronech hippocampu. Planární rafty obsahují flotillinové proteiny a nacházejí se v neuronech a leukocytech, kde nejsou přítomny kaveoly. Oba typy raftů mají podobné lipidové složení (jsou obohacené na cholesterol a sfingolipidy). Flotilliny a kaveoliny mají schopnost přivádět do lipidových raftů signální molekuly, a hrají tak důležitou roli například v signální transdukci neurotransmiterů. Tyto mikrodomény prostorově organizují signální molekuly, a tím usnadňují jejich interakce, které jsou nezbytné pro signální transdukci. Mohou ale také signální molekuly oddělovat, brání tedy jejich interakci a inhibují signalizaci.[19]

Signální transdukce na buněčné úrovni znamená proces, při kterém buňka převádí jeden druh signálu nebo stimulu na jiný. Přenos signálu nebo stimulu může být jednoduchý, asociovaný s molekulou receptoru. Komplexnější signální transdukce zahrnuje spřažení interakce ligand-receptor s mnoha dalšími intracelulárními ději. Tyto děje zahrnují fosforylace tyrosinovými kinázami a/nebo serin/threoninovými kinázami.[20] Specifita a přesnost přenosu signálu jsou pro buňky nezbytné k tomu, aby mohly efektivně reagovat na změny v prostředí. Toho je částečně dosaženo diferenciální lokalizací proteinů, které se účastní signálních drah. V plazmatické membráně může být této kompartmentalizace dosaženo pomocí lipidových raftů.[21] Jedním ze způsobů, jak můžeme uvažovat o lipidových raftech, je, že po aktivaci receptoru ligandem dochází ke shlukování malých raftů do větších signalizačních platforem.[22] Jestliže se aktivace receptoru odehrává v lipidovém raftu, je signalizační komplex chráněn před neraftovými molekulami, jako mohou být například membránové fosfatázy. Asociace proteinů s rafty tedy přivádí proteiny do nového mikro-prostředí, kde může být jejich fosforylační stav modifikován zde přítomnými kinázami, což může spouštět následnou signalizaci.[23] Lipidové rafty hrají roli v mnoha signálních procesech, jako je signalizace receptoru pro imunoglobulin E, antigenně specifického receptoru T a B lymfocytů, receptoru pro EGF, insulin a tak dále.

Lipidové rafty se také uplatňují v ději zvaném raft-dependentní endocytóza, a to kaveolární nebo nekaveolární (obojí nezávislé na klatrinu).

Pro vznik kaveolárních endocytických váčků je důležitá schopnost proteinu kaveolinu vytvářet oligomery (14–16 molekul) pomocí jeho oligomerizační domény. To vede v plazmatické membráně ke vzniku mikrodomén bohatých na kaveolin. Zvýšení obsahu cholesterolu a vložení „scaffolding“ domény kaveolinu do membrány zde pak vede k expanzi kaveolární invaginace a vzniku endocytického váčku. Váček je od plazmatické membrány odštěpen pomocí proteinu dynamin II, který je lokalizován na krčku vznikajícího váčku. Tento druh endocytózy se uplatňuje například při transcytóze albuminu v endoteliálních buňkách nebo internalizaci insulinového receptoru v primárních adipocytech.[37]

Nekaveolární raft-dependentní endocytóza může být závislá nebo nezávislá na dynaminu. Na dynaminu závislou a klatrinu nezávislou endocytózou jsou například v lymfocytech konstitutivně internalizovány receptory pro interleukin-2, lokalizované v lipidových raftech. Naopak na dynaminu nezávislá endocytóza se podílí například na pinocytóze nebo na internalizaci CT-B v myších embryonálních fibroblastech.[37]

Lipidové rafty také vytvářejí signalizační platformy pro spouštění jak proapoptotických, tak protiapoptotických drah. Lipidové rafty mohou ovlivňovat důležité apoptotické signalizační události, jako je aktivace apoptotických receptorů, aktivace nebo deaktivace proteinových kináz a změna intracelulární koncentrace vápníku. Toho využívá řada protinádorových léčiv, která jsou schopná narušit integritu lipidových raftů, a tím spustit apoptózu u nádorových buněk.[38]

Lipidové rafty se také uplatňují v buněčné adhezi a migraci, což jsou děje nezbytné například pro invazi nádorových buněk. Bylo ukázáno, že změna koncentrace cholesterolu mění regulovanou membránovou lokalizaci molekuly CD44, která je nezbytná pro zvýšení adhezivity a migrace nádorových buněk. Organizace lipidových raftů také ovlivňuje funkci integrinů, které jsou důležité pro mezibuněčný kontakt a kontakt s extracelulární matrix. Lipidové rafty jsou také potřeba pro vznik invadopodií, například u buněk rakoviny prsu. Invadopodia jsou výběžky invazivních nádorových buněk, které zajišťují degradaci extracelulární matrix, a usnadňují tak buňkám migraci.[39]

Jeden z hlavních důvodů ke kontroverzi okolo lipidových raftů pramení z námitek ohledně studia raftů v živých buňkách, které se nenachází v termodynamické rovnováze.[19] Lipidové rafty jsou malé mikrodomény o velikosti pohybující se mezi 10 a 200 nm[4], tedy pod rozlišovací schopností světelného mikroskopu, a je tak obtížné vizualizovat je přímo. V současné době jsou studovány syntetické membrány, jejichž používání má ale několik nevýhod. Za prvé, ve srovnání s biomembránami mají syntetické membrány nižší koncentraci proteinů. Také je obtížné modelovat interakce membrány s cytoskeletem, které jsou u biomembrán přítomny. Mezi další úskalí patří nepřítomnost přirozené asymetrie a nemožnost studovat membrány v nerovnovážných podmínkách.[4][40] Navzdory těmto nedostatkům je fluorescenční mikroskopie pro studium lipidových raftů často používaná. Například jsou využívány fluorofory konjugované s B-podjednotkou choleratoxinu (CT-B), která se váže na složku raftů, gangliosid GM1. Používají se také lipofilní membránové barvy, které se buď dělí mezi lipidové rafty a okolní membránu, nebo mění své fluorescenční vlastnosti podle fáze membrány. Příkladem takové barvy je Laurdan. Rafty mohou být také značeny za pomoci exprese fluorescenčních fúzních proteinů, například Lck-GFP.

Jednou z nejpoužívanějších metod pro studium lipidových raftů je manipulace s cholesterolem. Možnostmi jsou sekvestrace (pomocí filipinu, nystatinu nebo amfotericinu), deplece a odstranění (pomocí methyl-beta-cyklodextrinu) nebo inhibice syntézy cholesterolu (pomocí inhibitorů HMG-CoA reduktázy). Tyto přístupy například umožňují pozorovat účinky snížení hladiny cholesterolu na signalizaci neurotransmiteru.[19]

Sharma a kolegové použili vysokorozlišovací mikroskopii v kombinaci s matematickým modelováním a ukázali, že se raftové proteiny shlukují do nanoklastrů s poloměrem 5–20 nm. Dále pak pomocí FRET (fluorescence resonance energy transfer) mikroskopie ukázali, že frakce (20–40 %) GPI-kotvených proteinů se shlukuje do klastrů o poloměru 4–5 nm a že každý tento klastr se skládá z několika mála různých GPI-kotvených proteinů.[41] Aby se zamezilo problémům s malou velikostí a dynamickou strukturou, používají se také chlazené citlivé CCD kamery, sledující pouze jednu částici, a TIRF (total internal reflection fluorescence) mikroskopie. To umožňuje zjistit míru difúze částic a ohraničení jejich pohybu.[42]

Jsou také používány další optické techniky: pomocí FCS / FCC spektroskopie (fluorescence correlation a cross-correlation spectroscopy) můžeme získat informace o mobilitě fluoroforu v membráně, FRET mikroskopie může detekovat úzkou blízkost fluoroforů a pomocí optické pinzety můžeme studovat viskozitu membrány.[19]

Dalšími metodami jsou AFM (atomic force microscopy) mikroskopie, SICM (scanning ion conductance microscopy) mikroskopie, duální polarizační interferometrie, nukleární magnetická rezonance (NMR), i když fluorescenční mikroskopie zůstává dominantní technikou. V budoucnu by mohly být problémy plynoucí z difrakčního limitu překonány superrozlišovací mikroskopií, jako je STED (stimulated emission depletion) mikroskopie, nebo dalšími druhy mikroskopie.[43]

Metody používané pro analýzu lipidových raftů dále zahrnují ELISA, western blotting a FACS.[44][45][46]

Navzdory velkému množství experimentů, využívajících několik metod, není zatím role lipidových raftů v buněčné signalizaci, transportu a struktuře jasná, a dokonce i samotná existence raftů je stále kontroverzním tématem.[47]

Mezi argumenty proti existenci lipidových raftů patří:

• Mezi Lα a Lo fázi by mělo existovat hraniční napětí (line tension). To bylo pozorováno na modelových membránách, ale ne v živých systémech.
• Neexistuje žádný konsensus ohledně velikosti lipidových raftů. Pohybuje se mezi 1 a 1000 nm.
• Není známa doba existence lipidového raftu. I kdyby rafty existovaly, mohly by existovat jen velmi krátkou dobu, která by byla pro biologické procesy bezvýznamná.
• Celá membrána může existovat v Lo fázi.

Protiargumentem proti poslednímu bodu je, že Lo fáze lipidových raftů je těsněji uspořádaná díky intermolekulárním vodíkovým můstkům mezi sfingolipidy a cholesterolem.[48]

Další spor se týká efektivity rozrušování lipidových raftů během experimentů. Pike a Miller poukazují na potenciální problém při využití deplece cholesterolu pro určení funkce raftu.[49] Říkají, že většina vědců používá pro depleci cholesterolu metodu, která narušuje i strukturu lipidu známého jako PI(4,5)P2. PI(4,5)P2 hraje důležitou roli v regulaci buněčného cytoskeletu, a jeho odstranění může tedy vést ke stejným výsledkům jako deplece cholesterolu, například k laterální difúzi proteinů v membráně. Kwik s kolegy tedy uzavřeli, že ztráta určité buněčné funkce po depleci cholesterolu nemusí být nutně způsobena rozrušením lipidových raftů, protože mohou být ovlivněny i procesy na raftech nezávislé.[50][51] Také se myslí, že lipidové rafty jsou nějakým způsobem spojeny s proteiny. Edidin ale oponuje, že proteiny přitahují raftové lipidy přes své acylové řetězce.[52]

• Obrázky, zvuky či videa k tématu lipidový raft na Wikimedia Commons
• (anglicky) Vesmir.cz: Membránové rafty: historie a současnost^{[nedostupný zdroj]}