Bacillus subtilis
Bacillus subtilis je grampozitívna sporulujúca aeróbna baktéria. Je nepatogénna a žije v pôde.
| Bacillus subtilis | |
 | |
| Vedecká klasifikácia | |
|---|---|
| Vedecký názov | |
| Bacillus subtilis Ehrenberg, 1835 | |
| Vedecká klasifikácia prevažne podľa tohto článku |
Patrí medzi baktérie, ktoré na ťažký nedostatok výživných látok odpovedajú tvorbou endospóry – morfologicky odlišného typu bunky. Termín endospóra je v užšom zmysle vyhradený pre útvary tvorené bacilmi a klostrídiami, hoci podobné spóry produkujú aj streptomycéty. Endospóra je metabolicky stagnujúca a voči podmienkam prostredia veľmi odolná bunka schopná prežiť teplotné extrémy, sucho a vysokú dávky ionizujúceho žiarenia. Odhadovaná životnosť endospóry sa pohybuje medzi tisíckami až miliónmi rokov. Proces opätovnej premeny endospóry na metabolicky činnú baktériu sa nazýva germinácia alebo pučanie. Vďaka známemu genómu, nepatogénnosti a vonkajšej membráne bez obsahu lipopolysacharidov je Bacillus subtilis používaný na priemyselnú produkciu rekombinantných proteínov.
Sporulácia
Sporulácia začína asymetrickým delením, ktorým vzniká väčšia materská bunka a menšia prespóra. Oddeľuje ich priehradka (septum), ktorá je podobná priehradke pri bežnej amitóze, avšak má tenšiu vrstvu peptidoglykánu. Mnohé proteíny lokalizované v priehradke sú špecifické len pre jednu z jej strán. Priehradka sa postupne zakrivuje a prespóra vo vnútri materskej bunky sa ňou napokon celkom obalí. Zvláštne je, že septum je takmer hotové pred dokončením segregácie bakteriálneho chromozómu, takže prespóra spočiatku obsahuje len jednu tretinu chromozómu bližšiu k replikačnému počiatku. Po segregácii DNA spóry jej materská bunka začne poskytovať živiny. Od chvíle, kedy u vznikajúcej spóry nastúpi metabolická dormancia a jej DNA sa stane transkripčne inaktívna, materská bunka začne pracovať na tvorbe obalov spóry – dáva vznik tzv. kôre (cortex), vnútornému plášťu a vonkajšiemu plášťu. Proces zachytávania proteínov budujúcich tieto obaly prespóry a tiež ich schopnosť rozlíšiť „správnu“ membránu je stále predmetom intenzívneho výskumu. Na konci celého procesu sa materská bunka rozloží a uvoľní zrelú spóru.
Sporuláciu nevyhnutne sprevádza zmena génovej expresie a to tak pred samotným delením, ako aj neskôr v oboch kompartmentoch. Kľúčovým transkripčným faktorom v tomto procese je Spo0A, ktorého stav fosforylácie určuje jeho schopnosť viazať sa na promótory a tým regulovať génovú expresiu. Sporulácia je ďalej závislá od štvorice sigma faktorov, z ktorých každý rozpoznáva špecifickú skupinu promótorov a teda prepisuje špecifickú skupinu génov. Tieto sigma faktory sú označené ako F, G, E, K. Prvý z nich, sigmaF, sa v prespóre aktivuje po vytvorení septa a ovláda sekvenčnú aktivitu ostatných troch sigma faktorov. Jeho aktivácia je preto kontrolným bodom celej sporulácie.
Medzi najvýraznejšie morfologické zmeny sprevádzajúce sporuláciu patrí obalenie malej bunky membránou vo vnútri väčšej materskej bunky. Tento krok nasleduje po sformovaní septa. Tento proces vykazuje určité podobnosti s fagocytózou u eukaryotických buniek. Táto analógia však nie je príliš významná, nakoľko sporulujúce bunky sú obalené vrstvou peptidoglykánu, ktorý obalí aj prespóru. Peptidoglykán predstavuje pevné rozdelenie oboch buniek a je napojený na peptidoglykánovú vrstvu tvoriacu vonkajší obal komplexu materskej bunky a prespóry. Medzi materskou bunkou a prespórou sa nachádzajú dve membrány – vonkajšia membrána, ktorá sa začala formovať na strane polárneho septa materskej bunky a vnútorná membrána, ktorej budovanie započalo na prespórovej strane polárneho septa. Vonkajšia membrána je spočiatku spojená s cytoplazmatickou membránou, takže proteíny exprimované v materskej bunke prestupujú obidve membrány. Plášťové proteíny nie sú medzi sporulujúcimi druhmi všeobecne evolučne konzervované a ich identifikácia je technicky náročná.
Použitie v biotechnológiách
Bacillus subtilis patrí medzi najpoužívanejšie grampozitívne baktérie na priemyselnú produkciu rekombinantných proteínov, čiže proteínov neprirodzených pre jeho druh, ktoré sú umelo vnesené do jeho genómu technikami génovej rekombinácie. Priemyselné kmene B. subtilis sekretujú veľa rekombinantných proteínov a hostiteľské kmene používané na úspešnú expresiu proteínov sú často deletované pre gény amyE, aprE, nprE, spollAC, srfC a transformované pomocou prírodnej kompetencie. Genóm Bacillus subtilis bol zosekvenovaný a nenašla sa v ňom produkcia škodlivých exotoxínov a endotoxínov. Proteíny ním vytvorené možno spracovať jednoducho, bez potreby rozrušenia buniek alebo chemického spracovania. Toto má za následok relatívne veľký a cenovo výhodný výťažok.
Hlavným problémom produkcie proteínov v B. subtilis je, že produkuje množstvo proteáz, z ktorých niektoré rozkladajú rekombinantné proteíny. Patrí sem sedem známych proteáz, z ktorých päť je extracelulárnych:
- Subtilizín (aprE gén)- hlavná alkalická serínová proteáza
- Neutrálna proteáza (nprE)- hlavná metaloproteáza obsahujúca zinok
- Malá serínová proteáza (epr) - inhibovaná fenylmetánsulfonyl fluoridom (PMSF) a EDTA
- Bacilopeptidáza F (bpf) - malá serínová proteáza/esteráza; inhibovaná PMSF
- Malá metaloesteráza (mpe)
- ISP-I - veľká intracelulárna serínová proteáza vyžadujúca vápnik
- ISP-II - malá intracelulárna serínová proteáza
Prvé dva enzýmy sú zodpovedné za 96-98 % extracelulárnej protázovej aktivity. Ďalšie výskumné skupiny oznámili šesť až osem extracelulárnych proteáz. Kmeň B. subtilis vyvinutý pre génové inžinierstvo má deficit ôsmich extracelulárnych proteáz.
Pozri aj
Zdroje
- Department of Microbiology and Immunology, College of Physicians and Surgeons, Columbia University, New York, NY, USA. Recent progress in Bacillus subtilis sporulation [PDF online]. Príprava vydania Urs Jenal. Blackwell Publishing, 2011-10-25, [cit. 2012-02-23]. Dostupné online. DOI:10.1111/j.1574-6976.2011.00310.x (anglicky)
- DEMAIN, Arnold L.; VAISHNAV, Preeti. Production of recombinant proteins by microbes and higher organisms. Biotechnology Advances, 2009. DOI: 10.1016/j.biotechadv.2009.01.008. (anglicky)