NFAT

Ačkoli je fosforylace a defosforylace klíčová při řízení funkce NFAT maskováním a odhalováním jaderného lokalizačního signálu, jak ukazuje vysoký počet fosforylačních míst v regulační doméně NFAT, k této defosforylaci nemůže dojít bez přílivu iontů vápníku.[1]

Klasická signalizace závisí na aktivaci fosfolipázy C (PLC) prostřednictvím různých receptorů, jako jsou TCR (PLCG1) nebo BCR (PLCG2). Tato aktivace vede k uvolňování inositol-1,4,5-trifosfátu (IP3) a diacylglycerolu (DAG). IP3 je zvláště důležitý pro příliv vápníku, protože se váže na IP3 receptor umístěný v membráně ER. To způsobí krátké prudké zvýšení koncentrace vápníku v cytosolu, protože ionty opouštějí ER přes IP3 receptor.[4][6]

To však nestačí k aktivaci NFAT signalizace. Uvolňování iontů vápníku z ER je vnímáno proteiny STIM, které jsou transmembránovými proteiny v ER. Za normálních okolností se proteiny STIM vážou na ionty vápníku, ale pokud se většina z nich uvolní z ER, uvolní se také vázané ionty z proteinů STIM. To způsobí jejich oligomerizaci a následnou interakci s ORAI1, který je nepostradatelným proteinem komplexu CRAC. Tento komplex slouží jako kanál, který selektivně umožňuje příliv iontů vápníku z vnějšku buňky. Tento jev se označuje jako „zásobou zprostředkovaný vstup vápníku“ (z anglického store-operated calcium entry, SOCE). Pouze tento delší přítok vápenatých iontů je schopen plně aktivovat NFAT prostřednictvím defosforylace zprostředkované CaM/CN, jak je uvedeno výše.[4][6]

Ačkoli je SOCE hlavním aktivačním mechanismem většiny proteinů rodiny NFAT, lze je aktivovat také alternativní cestou. Tato cesta byla dosud ověřena pouze pro NFATc2. V této alternativní aktivaci je SOCE nevýznamný, což je ukázáno skutečností, že cyklosporin (CsA), který inhibuje defosforylaci zprostředkovanou CN, nepřeruší tuto dráhu. Důvodem je její aktivace prostřednictvím IL7R, což vede k následné fosforylaci jediného tyrosinu v NFAT, zprostředkované Jnk3 kinázou, členem podrodiny MAPK kináz.[6]

Jaderný import NFAT a jeho následný export závisí na hladině vápníku uvnitř buňky. Pokud hladina vápníku poklesne, exportní kinázy v jádře, jako je PKA, CK1 nebo GSK-3β, refosforylují NFAT. To způsobí, že se NFAT vrátí do svého neaktivního stavu a je exportován zpět do cytosolu, kde další kinázy dokončí refosforylaci, aby zůstal v inaktivovaném stavu.[4][7]

NFAT proteiny mají slabou afinitu k DNA.[8] Aby účinně vázaly DNA, musí proteiny NFAT spolupracovat s jinými rezidentními nukleárními transkripčními faktory, obecně označovanými jako NFATn.[9] Tato důležitá vlastnost transkripčních faktorů NFAT umožňuje integraci a detekci koincidence signálů vápníku s jinými signálními drahami, jako jsou ras-MAPK nebo PKC. Kromě toho se tato signální integrace podílí na tkáňově specifické genové expresi během vývoje. Screening sekvencí ncRNA identifikovaných v projektech sekvenování EST [10] objevil „ncRNA represor jaderného faktoru aktivovaných T buněk“ nazývaný NRON.[11]

NFAT-dependentní promotory a enhancery mají většinou 3 - 5 NFAT vazebná místa, což naznačuje, že pro účinnou transkripci jsou zapotřebí synergické interakce vyššího řádu mezi specifickými proteiny v kooperativním komplexu. Nejznámější druh těchto komplexů se skládá z NFAT a AP-1 nebo jiných bZIP proteinů. Tento komplex NFAT:AP-1 se váže na konvenční vazebná místa DNA proteinů rodiny Rel a podílí se na genové transkripci v imunitních buňkách.[3][12]

Stimulace TCR, jak je uvedeno výše, způsobuje defosforylaci NFAT, která pak téměř u každého druhu T buněk tvoří komplex s AP-1 (kromě Treg). Tento komplex v závislosti na cytokinovém kontextu pak aktivuje klíčové transkripční faktory v rozdílných subpopulacích T buněk: T-bet pro Th1, GATA3 na Th2, RORγ pro Th17 a BATF pro TFH. T buňky exprimují téměř všechny členy rodiny NFAT (kromě NFAT3). Každý NFAT však má jiný význam pro každou subpopulaci T buněk.[5][6]

Po stimulaci TCR a následné aktivaci T-bet (při působení Th1 cytokinů) komplex, který se skládá z transkripčního faktoru T-bet a NFAT, stimuluje produkci IFN-y, nejvýznamnějšího cytokinu buněk Th1. Aktivace TCR také spouští prostřednictvím komplexu NFAT:AP-1 produkci NFAT2/αA, což je krátká izoforma NFATc2, která postrádá C-koncovou doménu a plní roli autoregulátoru, protože dále zvyšuje aktivaci všech efektorových T buněk.[5][6] U odpovědi Th1 se NFATc1 jeví jako nepostradatelný, protože knockout NFATc1 u myší vede k nevyvážené reakci, složené zejména z odpovědi typu Th2.[5]

Při působení Th2 cytokinů je aktivován GATA3. Ten následně také interaguje s NFAT a spouští produkci Th2 typických cytokinů, jako jsou IL-4, IL-5 a IL-13. NFATc2 se jeví jako nejdůležitější pro odpověď typu Th2, protože jeho deaktivace snižuje množství výše zmíněných cytokinů a také snižuje množství IgG1 a IgE. NFATc1 hraje také důležitou roli, protože tvoří komplex s GATA3 stejně jako NFATc2. Tento komplex zprostředkovává produkci Th2 cytokinů nepřímo prostřednictvím regulace CRTh2.[5]

V souladu s Th1 a Th2 odpovědí stimulace TCR za Th17 podmínek vyvolává expresi RORy. Ten se následně váže na NFAT a stimuluje produkci specifických cytokinů Th17, jako je IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-22. V Th17 reakci pravděpodobně hraje NFATc2 klíčovou roli, protože myši s knockoutovaným NFATc2 vykazují redukci v RORy a i v IL-17A, IL-17F a IL-21.[5]

Treg buňky jsou jedinou výjimkou, jelikož netvoří komplex NFAT:AP-1. Po jejich stimulaci TCR se NFAT váže na SMAD3 místo AP-1. Tento komplex poté aktivuje transkripci FOXP3, hlavní regulátor genů v Treg buňkách. Komplex NFAT:FOXP3 pak reguluje produkci specifických Treg cytokinů. Existují dvě hlavní populace Treg buněk: přirozené Treg (nTreg) buňky, které se vyvíjejí v Thymu, a indukované Treg (iTreg) buňky, které se vyvíjejí z naivních CD4+ T buněk v periferii po jejich stimulaci. iTreg buňky jsou nejspíše vysoce závislé na NFATc1, 2 a 4, protože delece kteréhokoli z těchto genů nebo jejich kombinace způsobí téměř úplnou ztrátu iTreg buněk, ale nikoli nTreg buněk.[5][6]

V Tfh buňkách, stejně jako v Th1, Th2 a Th17 buňkách, se tvoří komplex NFAT:AP-1. Tento komplex poté aktivuje transkripci BATF, který se pak váže také na NFAT a společně s dalšími proteiny, jako je IRF4, zahajuje produkci molekul, které jsou pro Tfh nepostradatelné: CXCR5, ICOS, Bcl6 a IL-21. Buňky Tfh exprimují vysoké hladiny NFATc1, a zejména NFATc2 a NFAT2/aA, což naznačuje důležitou roli NFATc2. Delece NFATc2 v T buňkách způsobuje zvýšení počtu Tfh buněk a zvýšenou reakci v germinálním centru pravděpodobně v důsledku deregulace CXCR5 a sníženého počtu T folikulárních regulačních (Tfr) buněk.[5] Vzhledem k tomu, že Tfh jsou úzce spojeny s humorální odpovědí, jakákoli vada v nich se promítne do B buněk. Není proto překvapením, že ablace NFATc2 specificky ve všech lymfocytech způsobuje poruchu proliferace zprostředkovanou BCR, ale není jisté, zda je tento fenotyp způsoben pouze deregulací Tfh nebo B buněk, nebo jejich kombinací.[13]

Ačkoli byl objeven v T buňkách, je stále jasnější, že NFAT je exprimován také v různých jiných typech buněk. V B buňkách je exprimován hlavně NFATc1 a po aktivaci také NFATc2 a NFAT2/αA a plní důležité funkce, jako je prezentace antigenu, proliferace a apoptóza.[7] Ačkoli přerušení dráhy NFAT má vážné důsledky v T buňkách, v B buňkách se zdají být spíše mírné. Pokud se například provede specifické vyřazení B buněk z obou proteinů STIM, je SOCE zcela zrušen a s tím i signalizace přes NFAT. Ačkoli v těchto knockoutovaných B buňkách je výsledná humorální odpověď velmi podobná B buňkám bez knockoutu, úplné zrušení NFAT také způsobilo pokles IL-10.[6] Některé studie však naznačují důležitější roli NFAT v B buňkách, a proto toto téma stále není dobře pochopeno [13] a vyžaduje další výzkum.

Anergie T buněk je indukována suboptimálními stimulačními podmínkami, když je například stimulován TCR bez vhodných kostimulačních signálů. Vzhledem k chybějící kostimulaci chybí AP-1 a vytváří se komplex NFAT:NFAT. Tento komplex aktivuje geny asociované s anergií, jako jsou E3 ubikvitinové ligázy (Cbl-b, ITCH a GRAIL), diacylglycerolkináza α (DGKα) a kaspáza 3, které podporují indukci anergie T buněk.[6][8] Podobné jako T buněčná anergie je vyčerpání T buněk, které je také způsobeno nemožností tvorby komplexu NFAT:AP-1, ale samotná indukce stavu vyčerpání je způsobena spíše chronickou stimulací nežli suboptimální stimulací. Zdá se, že při anergii i vyčerpání hraje NFATc1 klíčovou roli. Naopak NFATc2 spolu s NFAT2/αA jsou potřebné ke zvrácení stavu anergie nebo vyčerpání.[6]