Izolace DNA

• Lýze buněk, která zajišťuje rozbití buněčné stěny a uvolní DNA. Používá se kombinace fyzikálních a chemických postupů. Důležitou roli hraje využití detergentů, které rozrušují membrány. V případě buněk s pevnými buněčnými stěnami musí dojít k enzymatickému nebo mechanickému rozrušení.
• Enzymatické odstranění RNA pomocí RNáz, případně i rozštěpení proteinů proteázami.
• Přečištění DNA od detergentů a ostatních složek lyzačního roztoku, proteinů, solí a dalších nečistot
  • Srážení alkoholem, nejčastěji ethanolem nebo isopropanolem, ve kterých DNA není rozpustná a je možné izolovat centrifugací. Pro efektivní srážení se často zvyšuje iontová síla přidáním octanu sodného nebo jiné soli
  • Fenol-chloroformová extrakce, při které se ke vzorku přidá fenol denaturující proteiny, které se vysráží na mezifázi vytvářené mezi fenolovou a vodnou fází. Zbytky fenolu jsou odstraněny přidáním chloroformu, který se pro svou vysokou hustotu snadno odděluje od vodné fáze. Pro izolaci DNA se využívá fenol v bazickém pufru, ve kterém RNA není stabilní.
  • Izolace pomocí minikolony využívající schopnost DNA vázat se na sklo nebo křemelinu v přítomnosti chaotropních solí, kterou jsou schopny vytvářet vazby zároveň se záporně nabitým sklem i záporně nabitou DNA. Po promytí ethanolem obsahujícím chaotropní soli a odstranění nečistot může být DNA uvolněna vodou nebo vhodným pufrem
• Po izolaci je DNA obvykle uchovávána v ultračisté vodě nebo ve vhodném pufru. Nejčastěji se používá slabě alkalický TE pufr, který obsahuje Tris udržující pH kolem 8 a EDTA chelatující dvoumocné kationty, které jsou nezbytné pro funkci DNáz a tak stabilizuje vzorek.

Podle typu vzorku, ze kterého probíhá izolace DNA, a podle požadované čistoty získané DNA, musí být zvolena vhodná technika izolace. Typickými vzorky, které jsou obtížně zpracovatelné a musí být pro ně využívána specifická technika, jsou například

• archeologické vzorky obsahující starou, částečně degradovadou DNA
• vzorky obsahující inhibitory PCR, například humusové kyseliny z půdy, indigo používané k barvení džínů nebo hemoglobin z krve
• vzorky z mikroorganismů s pevnou buněčnou stěnou, jako jsou houby, například kvasinky

Naopak při izolaci plazmidové DNA se využívá toho, že při lýzi buněk a následném sražení proteinů je chromozomální DNA zachycena mezi sraženými proteiny a jednoduchou centrifugací je možno odstranit většinu nečistot. Rozpustná frakce obsahující malé kruhové molekuly plasmidové DNA se následně oddělí a srážením se z ní izoluje DNA.