Fosforylace

V roce 1906 Phoebus A. Levene v Rockefellerově ústavu pro lékařský výzkum identifikoval fosfát v bílkovině vitellin,[1] a v roce 1933 Fritz Lipmann objevil fosfoserin v kaseinu.[2] Nicméně trvalo dalších 20 let, než Eugene P. Kennedy popsal první "enzymatickou fosforylaci proteinů".[3]

Reverzibilní fosforylace proteinů je důležitý regulační mechanismus, který se vyskytuje u prokaryotických i eukaryotických organismů.[4][5][6][7] Kinázy fosforylují bílkoviny a fosfatázy bílkoviny defosforylují. Mnohé enzymy a receptory jsou ve stavu "zapnutý" nebo "vypnutý" prostřednictvím fosforylace a defosforylace. Reverzibilní fosforylace vede ke konformačním změnám struktury mnohých enzymů a receptorů, které způsobují aktivaci nebo deaktivaci. Fosforylace se v eukaryotických proteinech obvykle vyskytuje na aminokyselinách serin, threonin, tyrosin a histidinových zbytcích. Histidinová fosforylace eukaryotických proteinů je častější než fosforylace na tyrosinu. V prokaryotických bílkovinách dochází k fosforylaci zbytků aminokyselin serin, threonin, tyrosin, histidin, arginin nebo lysin.[4][5][8][8][9] Přidáním fosfátových iontů (HPO 2-
4 ) na polární R skupiny aminokyselinových zbytků se mohou změnit hydrofobní části proteinu na polární a extrémně hydrofilní část molekuly. Tímto způsobem je možné zavést konformační změnu ve struktuře proteinu prostřednictvím interakce s jinými hydrofobními a hydrofilními částmi proteinu. Jeden takový příklad regulace je fosforylace p53 tumor supresorových proteinů. Protein p53 je silně regulován[10] a obsahuje více než 18 různých míst fosforylace. Aktivace p53 může vést k zástavě buněčného cyklu, který může být obrácen a za určitých okolností může vést k apoptotické buněčné smrti.[11] Tato aktivita se vyskytuje pouze v situacích, kdy jsou buňky poškozené, nebo je u zdravých jedinců narušená jejich fyziologie. Po deaktivačním signálu je protein znovu defosforylován a přestane fungovat. Aktivace fosforylací je mechanismus, který se vyskytuje v mnoha formách přenosu signálů, jako například způsob, jakým se světlo zpracovává ve světločivných buňkách sítnice.

Regulační role fosforylace:

• Termodynamika biologických systémů pro reakce vyžadující energii
  • Fosforylace Na⁺/K⁺-ATPázy během přepravy sodíkových (Na⁺) a draslíkových (K⁺) iontů přes buněčnou membránu v osmoregulaci pro udržení homeostázy v těle.

• Zprostředkování inhibice enzymu
  • Fosforylace enzymu GSK-3 pomocí protein kinázy B jako součást inzulinové signální dráhy.[12]
  • Fosforylace Src tyrozin kinázy přes C-terminální Src kinázu (Csk) indukuje konformační změnu v enzymu, která zakrývá jeho kinázové domény, a tak se vypne kinázová aktivita.[13]

• Protein-proteinové interakce prostřednictvím "rozeznávacích domén"
  • Fosforylace cytosolických komponentů NADPH oxidázy, což je velký membránově vázaný multi-proteinový enzym přítomný u fagocytárních buněk, hraje důležitou roli v regulaci protein-proteinových interakcí v tomto enzymu.[14]

• Degradace proteinů
  • V roce 1990 bylo zjištěno, že fosforylace některých proteinů způsobuje jejich degradaci přes ATP-dependentní ubiquitin / proteazomové dráhy. Tyto cílové proteiny se stanou substráty pro jednotlivé E3 ubiquitin ligázy pouze tehdy, jsou-li fosforylovány.

Objasnění komplexní signální dráhy fosforylace může být obtížné. V buněčných signálních drahách protein A fosforyluje protein B a protein B pak fosforyluje protein C. Nicméně, v jiných signálních drahách protein D fosforyluje protein A, nebo fosforyluje protein C. Globální přístupy jako je fosfoproteomika (což je studium fosforylovaných proteinů prostřednictvím proteomiky v kombinaci s hmotnostní spektrometrií), byly využity k identifikaci a kvantifikaci dynamických změn fosforylovaných proteinů v průběhu času. Tyto techniky jsou důležité pro systematickou analýzu komplexních fosforylačních sítí.[15] Byly úspěšně použity k identifikaci dynamických změn ve stavu fosforylace na více než 6000 místech po stimulaci epidermálním růstovým faktorem.[16]

Jiný přístup k pochopení fosforylačních sítí je na základě měření genetické interakce mezi více fosforylovanými proteiny a jejich cíli. To ukazuje zajímavé opakující se vzorce interakcí tzv. síťové motivy.[17]

Existuje tisíce různých fosforylačních míst v dané buňce, protože:

• Existuje tisíce různých druhů bílkovin v konkrétní buňce (například lymfocytů)
• Odhaduje se, že 1/10 až 1/2 proteinů je fosforylována (v určitém buněčném stavu)
• Fosforylace se často vyskytuje na několika různých místech na daném proteinu

Fosforylace jakéhokoli místa na daném proteinu může změnit funkci nebo lokalizaci tohoto proteinu. Například, pokud je aminokyselina Serin-473 ("S473") v proteinu AKT fosforylována, protein kináza B je funkčně aktivní jako kináza. Pokud protein kináza B není fosforylována, je to neaktivní kináza.

Uvnitř bílkoviny může dojít k fosforylaci na několika aminokyselinách. Fosforylace na serinu je nejčastější, hned za ním následuje threonin. Tyrosinová fosforylace je poměrně vzácná. Vzhledem k tomu, že tyrosin-fosforylované proteiny je poměrně snadné purifikovat pomocí protilátek, jsou fosforylace prostřednictvím tyrosinu poměrně dobře prozkoumané. Fosforylace histidinu a aspartátu se vyskytují hlavně u prokaryot jako součást dvousložkové signalizace. V některých specifických případech se může vyskytovat také v signálních drahách u eukaryot.[18]

Protilátky mohou být použity jako výkonné nástroje pro detekci toho, zda je protein na určitém místě fosforylován. Protilátky vážou a detekují konformační změny vyvolané fosforylací proteinů. Tyto protilátky se nazývají fosfo-specifické. Nyní jsou k dispozici stovky těchto protilátek.[19] Jsou to důležité biochemické nástroje a to jak pro základní výzkum, tak pro klinické diagnózy.

Příklad posttranslační modifikace detekované na 2D gelu YUI(hranice byly vymezené podle analytického softwaru, identifikace byla provedena hmotnostní spektrometrií, P46462 je ID proteinu v Expasy)