DNA čip

Za počátky DNA microarray se pokládá hybridizace kolonií bakterie E. coli provedená Grunsteinem a Hognesem, 1975. Bakterie E. coli obsahují různorodé hybridní plazmidy a díky jejich metodě bylo možné rychle zjistit specifické sekvence DNA nebo geny, které se na daném plazmidu nacházejí. Kolonie E. coli byly přesunuty na nitrocelulózový filtr, zlyzovány a jejich DNA byla denaturována a přichycena na filtr in situ. Poté se pomocí přihybridizované radioaktivní RNA označila místa zájmu na DNA. Grundstein a Hognes pomocí této metody izolovali kolonie obsahující plazmid s genem z Drosophily melanogaster pro 18 a 28S rRNA.[1] Na počátku 90. let skupina Hanse Lehracha zautomatizovala tento proces pomocí robotického systému, který rychle uspořádával klony z destičky na filtr.[2] Na přelomu tisíciletí došlo k rychlému pokroku zapojením fluorescenční detekce, která je citlivější a levnější než radioaktivní značení. Začaly se využívat delší sekvence (25-60 bp) díky rozšíření sekvenování genomů, a s tím souvisejícím rozvojem databází genomů.  Tyto inovace vedly ke zvýšení specificity čipů. Například byl vytvořen referenční čip pro člověka, Lennon 1996.[2][3] Byly vyvinuty 3 rozdílné typy mikročipů: „čipy na sklíčku“ (spotted arrays on glas), „samo skládající se čipy“ (self assembled arrays) a „in situ syntetizované čipy“ (in situ synthesized arrays).[4]

Metoda DNA čipů je založena na paralelní hybridizaci značených sekvencí nukleových kyselin ze vzorku se specifickými sondami ukotvenými na podkladu. Fixováním sond na pevný povrch je umožněno je prostorově oddělit a paralelizovat hybridizační reakce. Nukleotidová sekvence je základem pro specificitu daných sond. Od konce 20. let došlo k masivnímu rozvoji této technologie, nejenom k její adaptaci k mnoha různým účelům, ale i k vývoji řady dalších jejích variací. Vzhledem k prudkému rozvoji na trhu komerčních DNA čipů a tím se zvyšující konkurence, se efektivně snižuje finanční náročnost této technologie.[5]

Podle aplikace

• RNA aplikace

3 možné aplikace: sledování exprese mRNA, exonů nebo krátkých RNA. Celkové zlepšování analytických a sekvenačních metod umožňuje detailní analýzy transkriptomu pomocí DNA čipů. Exonové DNA čipy obsahují reprezentativní sondy pro jednotlivé exony a ne pro jednotlivé geny, což umožňuje podrobnější a kvalitativně lepší analýzu genové exprese a alternativního sestřihu exprimovaných genů. Studium krátkých RNA pomocí DNA microarray je obtížné hlavně kvůli návrhu sond, které musí být dostatečně specifické i při velké sekvenční homologii různých krátkých RNA. Rozdíl mezi některými sekvencemi krátkých RNA může totiž být pouze jeden nukleotid.[5]

• DNA aplikace

5 možných aplikací: arrayCGH, genotypizace (SNP array), ChIP-on-chip, resekvenování a analýza methylace DNA. CGH, neboli komparativní genomová hybridizace je metoda umožňující analýzu celého genomu v jednom experimentu. ArrayCGH jsou určeny pro sledování změn v počtu kopií úseků DNA. Více používané jsou SNP ("single nucleotide polymorphism") microarray, které kombinují v jednom produktu dvě analýzy, genotypizaci a CNV ("copy number variation"). ChiP-on-chip ("Chromatin immunoprecipitation on chip") a analýza methylace DNA jsou epigenetické analýzy založené na metodě "tilling microarray". Ta využívá sondy s velikou hustotou pokrytí navržené tak, aby rovnoměrně pokrývaly určité úseky genomu. K resekvenování jsou v současné době používány především DNA s krátkými oligonukleotidy.[5]

Mikropole

DNA čip je založen na principu párování komplementárních bází nukleotidů – spojení vodíkovými můstky. Možných postupů při experimentu je více, tradiční experiment pro zjištění genů exprimovaných v jedné buňce v daném okamžiku lze popsat zhruba takto:

1. Vytvoření DNA čipu: Vybrané DNA oligonukleotidy – jednovlákna (například části genů, genové reportéry) známých sekvencí, nazývaná sondy jsou speciálními metodami přichyceny k povrchu destičky pevnou kovalentní vazbou. Vždy několik stejných molekul na jednom místě tvoří tzv. vlastnost, vlastnosti jsou na destičce prostorově odděleny.
2. Vytvoření vzorku: Typickým příkladem vzorku je všechna mRNA přítomná v určité buňce v určitém okamžiku. Vzorek musí být nejdříve purifikován ("vyčištěn"), (např. elektroforézou, PCR se specifickými primery) poté je reversní transkripcí převeden do cDNA. Dále může proběhnout amplifikace pomocí PCR pro zajištění dostatečného počtu molekul požadovaných typů ve vzorku a dělení molekul cDNA na kratší pomocí restrikčních endonukleáz. Během reverzní transkripce, PCR amplifikace či po nich probíhá nezbytný krok označení molekul. Ke každé molekule je připojeno několik molekul (typicky zhruba jedna na každých 60 bází) fluorescentní (popř. jiné, např. radioaktivní) látky, jejíž přítomnost, popř. množství bude možno později detekovat. Typickými fluorescenčními látkami používanými pro tyto pokusy jsou fluorofory. Molekuly vzorku jsou před aplikací na čip denaturovány. Výsledným vzorkem je tedy směs jednovláken DNA označených detekovatelnou látkou.
3. Hybridizace vzorku s čipem: Po kontaktu s DNA čipem molekuly vzorku hybridizují s komplementárními sondami (molekulami na čipu). Čím větší je sekvenční podobnost (resp. komplementarita, viz nukleová báze) sond s molekulami vzorku, tím větší počet vodíkových můstků mezi nimi vznikne a tím pevnější je vazba.
4. Omytí čipu: Po omytí zůstanou na čipu sondy, pevně přichycené kovalentní vazbou k jeho povrchu a molekuly vzorku přichycené dostatečně pevně na sondách. Molekuly vzorku přichycené na sondách nedostatečným počtem vodíkových můstků, tedy nedostatečně sekvenčně podobné, jsou odplaveny.
5. Skenování čipu: Po Skenování čipu: Po excitaci laserem vyzáří molekuly barviva (způsob s použitím fluorescentního barviva) přítomné na molekulách vzorku přichycených na sondách světlo určité vlnové délky. Světlo vyzářené každou vlastností je detekováno.
6. Zpracování výsledků: Předchozím postupem získáme informaci o tom, ke kterým sekvencím uchyceným na čipu existovaly komplementární sekvence ve vzorku. Podle intenzity vyzářeného světla lze určit i množství komplementárních molekul přítomných ve vzorku, běžně se ovšem pracuje pouze s relativním množstvím. Jsou tedy pouze porovnávána množství světla vyzářená jednotlivými vlastnostmi pro zjištění poměrů, v jakých byly jednotlivé sekvence ve vzorku přítomny. Zjištění absolutní koncentrace jednotlivých sekvencí ve vzorku je problematické. Charakter získaných dat vyžaduje pokročilé počítačové zpracování. Nejdříve je třeba digitální zpracování obrazu, získaná data jsou potom analyzovány metodami bioinformatiky.
7. Analýza dat: Prvním z několika kroků je převod obrazové informace na numerická data, které je pak možno dále zpracovávat. Primární data jsou totiž v podobě digitalizovaného obrazu, protože k detekci vazby vzorku na čip jsou používány hlavně optické metody jako fluorescence nebo chemiluminiscence. Pro vlastní statistické zpracování je nutné data upravit tak, aby byl minimalizován vliv nebiologických zdrojů variability. K tomuto účelu slouží metody pro normalizaci dat. Normalizace umožňuje porovnání expresních hodnot genů mezi různými hybridizacemi nebo v případě dvoukanálových technik porovnání míry genové exprese ve vzorcích označených různými fluorofory.[5]

Kroky nutné k provedení experimentu s DNA čipem

Detail DNA čipu po dvoukanálovém experimentu. Různý poměr molekul z jednotlivých vzorků hybridizovaných na sondách způsobuje různé zabarvení světla vyzářeného z míst jednotlivých vlastností

Popsaný postup může být upraven požitím směsi dvou vzorků (např. ze zdravých a rakovinných buněk či z buněk jednoho druhu v různých podmínkách) označených různými barvivy (typicky červeným a zeleným). Výsledkem je potom relativní informace o rozdílu v expresi genů mezi vzorky, lze tak jednoduše zjistit například které geny jsou vlivem nemoci v buňkách podexprimované a které nadexprimované. Tímto způsobem bude použit pouze jeden místo dvou čipů, což snižuje cenu. Nevýhodou je však horší porovnatelnost výsledků s jinými experimenty a také fakt, že pokud je jeden ze vzorků nekvalitní, znehodnotí i analýzu druhého, byť kvalitního vzorku.

Existuje mnoho variant postupů při výrobě DNA čipů, dva základní přístupy jsou tyto:

1. Tištěné DNA microarray: Vyrábí se natisknutím chemicky syntetizovaných oligonukleotidových sekvencí na povrch mikročipu. Tyto sekvence jsou roboticky nakapány nebo natištěny na velmi jemnou mřížku. Na poklad jsou nanášeny nano až picolitry roztoku s nukleovými kyselinami v takových odstupech, aby nedošlo ke kontaminaci.  Nejčastěji využívaným povrchem microarray je sklo, jelikož je celkem stabilní vůči vyšším teplotám a oplachování, umožňuje dobrou hybridizační kinetiku, má minimální fluorescenční šum na pozadí. V neposlední řadě, jeho používání je ekonomicky dobře dostupné.
2. In situ syntetizované microarray: Tento princip výroby využívá fotolitografii. Celá podkladová destička je nejdříve zakryta inertním materiálem, ten je poté na požadovaných místech odkryt a destička je vnořena do směsi obsahující pouze nukleotidy jednoho druhu. Ty se po jednom přichytí na odkrytá místa. Destička je opět zakryta, odkryta na dalších místech dle plánu a ponořena do směsi s dalším nukleotidem. Takto jsou postupně syntetizovány celé požadované sekvence. Tento přístup je vhodný na čipy s kratšími oligonukleotidy.
3. Vysoko-hustotní kuličkové DNA microarray: Technologie založena na barevně-kódované 3micron silikových korálcích, které se sami náhodně složí do vlákna a následně na destičku. Hustota sekvencí navázaných na korálcích je 40 000 na mm2 a to je 400x větší hustota než na tištěných microarray. Každý korálek je pokryt sta tisíci stejných kopií oligonukleotidů.[7]

DNA čipy fungují na principu nepřímého měření relativní koncentrace – měřený signál by měl odpovídat množství přihybridizované DNA. Dochází zde ale k omezení hybridizační kinetiky a měřený signál není vždy lineární k množství navázané DNA. Při velkém množství stejných hybridizujících úseků na DNA, dochází k saturaci čipu, v opačném případě při velmi nízkých koncentracích nevzniká žádný signál, i přesto, že je DNA přihybridizovaná.  Další problém se týká především savčích genomů, které obsahují velké množství podobných sekvencí. Pokud máme například gen A a k němu blízké homology geny B, C DNA čip je může detekovat také jako gen A, což vede k falešným výsledkům. Problematická je také detekce genových produktů, které mají více sestřihových variant. Musíme si také uvědomit, že DNA čipy jsou schopné detekovat pouze sekvence, které jsou známé a byla pro ně vytvořena komplementární sekvence na čipu. To může být problematické u druhů, které mají vysoce variabilní genom.[2]