Avidin-peroxidáza

Avidin-peroxidáza (též avidin-peroxidasa) je modifikovaná peroxidáza (nejčastěji získávaná z křenu selského, Armoracia rusticana), na kterou je kovalentně připojen protein avidin (z vaječného bílku).

Peroxidáza je enzym, tzn. patří mezi proteiny; zde znázorněna glutathion peroxidáza

Použití
Mikrofotografie lidských HeLa buněk; tmavé skvrny znázorňují místa, kde se vyskytuje v buňce protein transferin, a to právě pomocí vazby křenové peroxidázy na bílkovinu transferin

Avidin-peroxidáza se velmi často používá v laboratoři k vizualizaci různých biochemických interakcí (protein-proteinových, protein-sacharidových, …), u nichž jeden z účastníků této interakce je modifikován biotinem. Avidin je schopen se specificky a velmi silně vázat na biotin a přes tzv. avidin-biotinový můstek je tedy schopen připojit peroxidasu k interagujícím látkám.

Peroxidáza pak po dodání zdroje peroxidu (H2O2, NaBO3, …) a vhodného substrátu (jenž oxiduje a změní jeho vlastnosti –barva, rozpustnost) vizualizuje tuto interakci. Příkladem vhodných substrátů můžou být 4-chloro-1-naftol - po oxidaci dochází ke vzniku nerozpustné fialové látky – a ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonát), který tvoří stabilní, zeleně zbarvené rozpustné radikály.

vzorec ABTS

Avidin peroxidasy se často využívá při metodě ELISA a ELBA metodě a při western blotu. Podobně jako avidin-peroxidasa se však také často využívá kyselá nebo alkalická avidin-fosfatáza.

Stavební částice

Křenová peroxidáza
křenová peroxidáza
alternativní názvy HRP, horseradish peroxidase
zdroj křen selský (Armoracia rusticana)
molekulová hmotnost ~44 000[1]
počet isoenzymů 7[2]
pI 3-9
pH optimum 6-6,5[3]
inhibitory CN−, S2−, F−, N3−, Fe3+,[4]

Avidin
biotin
avidin
zdroj vaječný bílek
molekulová hmotnost homotetramer, celková Mr = 66-69 000
pI 10,5
biologická funkce antimikrobiální agents, vyvazuje biotin nutný pro růst bakterii (KD(avidin-biotin) = 1,10-15M)

Podobně jako avidin se používá i streptavidin - protein o podobných vlastnostech jako avidin (silná a specifická vazba biotinu) izolovaný z Streptomyces avidinii. Na rozdíl od avidinu není streptavidin vůbec glykosylován.

Používané substráty avidin peroxidázy
zkratka název rozpustnost produktu
DAB 3,3'diaminobezidin N
4-CN 4-chloro-1-naftol N
HYR Hanker-Yaks reagent N
AEC 3-amino-9-ethylethanol N
TMB 3,3',5,5'-tetrametylbenzidin N
OPD o-fenylendiamin R
ABTS 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonát R

Příprava avidin-peroxidázy

Křenová peroxidáza je kovalentně připojena na avidin pomocí bismaleimidu (dimaleimidu) v poměru přibližně 2:1 (HRP:avidin)[5]

Odkazy

Reference
  1. Welinder, K.G., Eur. J. Biochem., 96, 483–502 (1978)
  2. Shannon, L.M., et al., J. Biol. Chem., 241, 2166–2172 (1966).
  3. Schomberg, D., Salzmann, M., and Stephan, D., Enzyme Handbook 7, EC 1.11.1.7:1–6 (1993).
  4. Zollner, H., Handbo]ok of Enzyme Inhibitors, 2nd Ed., Part A: 367–368 (1993).
  5. O'Sullivan MJ, et al, FEBS letters, 35, 311-313 (1978).

Související články
This article is issued from Wikipedia. The text is licensed under Creative Commons - Attribution - Sharealike. Additional terms may apply for the media files.