ELISA

ELISA (z angl. Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay), někdy také označovaná jako EIA (Enzyme Immunoassay) je jednou z nejpoužívanějších imunologických metod sloužících k detekci a stanovení koncentrace antigenů nebo protilátek. Principem této metody je imunoenzymatické reakce bezbarvého (chromogenního) substrátu, který je hydrolyzován v barevný produkt a lze měřit spektrofotometricky. Intenzita zabarvení koreluje s koncentrací detekovaného antigenu nebo protilátky. ELISA využívá dvou základních vlastností imunoglobulinů. Za prvé je to schopnost vázat se na povrch plastů (např. polystyrenu) a v druhé řadě pak schopnost vázat enzymy na Fc fragmenty (viz protilátka) imunoglobulinových molekul.

Základní složky ELISA testu
Klasická 96-jamková destička pro metodu ELISA
  1. Antigen
    • detekovaný v testovaném vzorku
    • známý, komerčně připravovaný
  2. Protilátka
    • detekovaná v testovaném séru
    • známá, komerčně připravovaná
  3. Konjugát
    • jedná se opět o protilátku proti protilátce (konkrétně proti druhově specifickým imunoglobulinům příslušného izotypu (proti IgG, IgM, IgA, viz protilátka), na kterou je navázaný enzym (konjugovaná enzymem)
  4. Substrát
    • je chemická látka, která reaguje s enzymem a tím změní svou barvu

Pro imunoenzymatickou reakci jsou používány různé typy enzymů a substrátů (enzym/substrát):

Alkalická fosfatáza (AP) / paranitrofenyl fosfát (PNPP), žlutý produkt rozpustný ve vodě, absorbuje světlo o vlnové délce 405 nm

Křenová peroxidáza (HRP) / 2,2'-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6- kyselina sulfonová]-diammoniová sůl (ABTS) zelený produkt, absorbuje světlo o vlnové délce 410 a 650 nm, ortho-fenyldiamin dihydrochloride (OPD) ve vodě rozpustný žluto-oranžový produkt, vlnová délka 492 nm, 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin (TMB) modrý produkt, po přidání kyseliny sírové nebo fosforečné přeměna na žlutý produkt, absorbance 450 nm.

Beta galaktosidáza (β-Gal)[1] / o-nitrofenol-β-D-galactopyranosid (ONPG)[2], Naftol-AS-Bl-beta-D-galactopyranosid (Nap-Gal), and 4-Methyl-umbelliferyl-beta-D-galactopyranosid (MUm-Gal), chlorfenolová červeň β-D-galactopyranosid (CPRG)

Způsoby detekce antigenu

Používají se tyto čtyři detekce:[3]

  • Přímá ELISA

Primární protilátky jsou přímo konjugované s enzymem.

  • Nepřímá ELISA
  1. Primární protilátky jsou konjugované s biotinem (následuje přidání streptavidinu konjugovaného s enzymem)
  2. Na antigen se vážou neznačené primární protilátky, na které se následně vážou sekundární protilátky konjugované s enzymem nebo biotinem
  • Sendvičová ELISA

Dno jamky 96-jamkové destičky je potažené protilátkami, které vážou antigen. Na antigen se vážou i detekční protilátky. Může se jednat o ELISA přímou i nepřímou.

  • Kompetitivní ELISA

Primární protilátka je inkubována s antigenem. V reakci vznikají komplexy antigenu s protilátkou. Čím více antigenu je ve vzorku, tím méně volných protilátek zůstane. Tato suspenze je poté přidány do jamky s imobilizovaným antigenem. Volné primární protilátky se vážou na imobilizovaný antigen a jsou detekovány enzymaticky značenými sekundárními protilátkami. Nakonec je přidán chromogenní substrát. Koncentrace antigenu je nepřímo úměrná intenzitě signálu.

[4]

Praktické použití

Metody ELISA se využívají k diagnostice infekčních nemocí člověka a zvířat. Stanovují se buď protilátky proti konkrétnímu patogenu nebo se detekují přímo prionové, virové, bakteriální, parazitární antigeny. Antigen lze detekovat v séru, tkáních a tkáňových tekutinách (např. mozkomíšní mok), trusu (stolici) a slinách atd. Detekce patogenů v trusu se označuje jako koproantigen ELISA. Dále se ELISA používá k detekci některých toxinů, hormonů, celé řady proteinů, případně dalších bioaktivních látek. Vědci pracují i na vývoji metod ELISA pro kosmický výzkum, například k detekci forem života na Marsu.

Modifikace ELISA testu

Reference
  1. β-Gal ELISA 11539426001. Sigma-Aldrich [online]. [cit. 2018-04-11]. Dostupné online.
  2. ONPG (o-nitrophenyl--D-galactopyranoside) - Thermo Fisher Scientific. www.thermofisher.com [online]. [cit. 2018-04-11]. Dostupné online. (anglicky)
  3. BIO-RAD. Types of ELISA | Bio-Rad. Bio-Rad. Dostupné online [cit. 2018-04-11]. (anglicky)
  4. BIO-RAD. ELISA Protocols (All Types) | Bio-Rad. Bio-Rad. Dostupné online [cit. 2018-04-11]. (anglicky)
  5. MAGNUSSON, Karl-Eric. Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay (FLISA) for Quantification of Antibodies to Food Antigens. A Journal of Molecular and Cellular Immunology. 1987, roč. 16, čís. 3. Dostupné online.

Literatura
  • Toman M. a kol.: Veterinární imunologie. Grada Publishing, Praha, 2000.
  • Tijssen P.: Practice and Theory of Enzyme Immunoassays. Elsevier, Amsterdam, 1985.
  • Tizard, I.R.: Veterinary Immunology - an introduction. Saunders co., Philadelphia, 1996.

Externí odkazy
This article is issued from Wikipedia. The text is licensed under Creative Commons - Attribution - Sharealike. Additional terms may apply for the media files.