Rekombinantní protilátky

Existuje několik známých a běžně produkovaných rekombinantních protilátek, které dělíme podle jejich způsobu produkce, původní struktury, ze které vycházejí a vazebné specifity. Mezi základní typy rekombinantních protilátek patří Fab fragmenty, již zmiňované scFv a bispecifické protilátky.[4][5][6] Každý z těchto typů má odlišné využití a může být využíván v širokém spektru aplikací od výzkumu přes lidskou po veterinární medicínu.[7] Další oblastí, která je zkoumána je vývoj anti-idiotypových protilátek. Anti-idiotypové protilátky se váží na paratop jiné specifické protilátky, což umožňuje jejich využití při měření a určování množství protilátek a koncentrace léčiv v séru pacienta.[8] Na základě místa vazby a vazebné specifity, dělíme anti-idiotypové protilátky na tři typy, které se částečně překrývají s již navrženým dělením výše. Prvním typem jsou tzv. klasické protilátky. Pod tímto pojmem se skrývají Fab fragmenty, protilátky, které se váží na idiotop mimo vazebné místo pro léčivo, a protilátky, které se váží pouze na komplex léčiva s cílovou protilátkou.[8] Nejčastěji jsou využívané scFv, Fab fragmenty a bispecifické protilátky.

scFv je nejmenší typ rekombinantní protilátky, který je schopen vázat antigen.[9] scFv mají molekulovou hmotnost okolo 27kDa.[10] Jde o rekombinantní protilátky, tvořené lehkým a těžkým řetězcem variabilní oblasti imunoglobulinu. Tyto dva řetězce jsou spojeny pružným spojením, tzv. linkerem.[2] Pružný linker obvykle sestává z krátké několikrát se opakující sekvence čtyř glycinů a serinu [5] a slouží ke stabilizaci celé struktury, čímž přispívá k její funkčnosti.[9][11] Funkčnost může být dále zvýšena vazebně specifickými chemickými modifikacemi, mezi které patří například vazba peptidového tagu nebo fúze s dvou genů, která vede ke vzniku bispecifické rekombinantní protilátky.[10] Pro zajištění správné funkce je třeba zkontrolovat vazebnou afinitu a aktivitu výsledné protilátky. Pro zjištění přítomnosti dané protilátky se běžně používá test ELISA. [12]

Strukturně se Fab fragmenty skládají ze dvou párů variabilních a konstantních komponent, které tvoří stabilní strukturu dvou polypeptidových řetězců.[5] Pokud nahlížíme na Fab fragmenty z pohledu anti-idiotypových protilátek, jedná se o rekombinantní protilátky, které se váží přímo do vazebného místa paratopu na cílové protilátce. V praxi to znamená, že konkurují léčivu na vazebném místě a mají tak inhibiční funkci. Protilátky tvořené Fab fragmentem mohou být používány k detekci nenavázaného léčiva, případně léčiva, které se vyskytuje volně v séru.[8] Fab rekombinantní protilátky se používají v případě, kdy existuje riziko rozvoje negativních vedlejších účinků způsobených nespecifickou vazbou Fc části protilátky. Fab rekombinantní protilátky nenesou žádnou Fc oblast.[5] Fab fragmenty se také používají v případech, kdy je nutné podat pacientovi nebo použít v diagnóze či experimentu rekombinantní IgG imunoglobulin. Rekombinantní Fab fragmenty jsou konvertovány na rekombinantní formu IgG imunoglobulinu. Tento způsob přípravy rekombinantních IgG dále rozšiřuje možnosti využití rekombinantních protilátek i počet jejich cílových struktur.[13]

Vedle scFv a Fab fragmentů se mezi rekombinantní protilátky počítají i bispecifické protilátky.[5] Bispecifické protilátky spojují dohromady dvě rozdílné antigen vazebné specifity do jedné rekombinantní molekuly.[11] Bispecifické protilátky se používají k provázání neboli crosslinkování cílové molekuly se dvěma rozdílnými buňkami nebo mohou přímo zprostředkovávat cílenou cytotoxicitu.[14][15]

Tvorba rekombinantních protilátek probíhá podle jednotné strategie. Nejdříve je potřeba určit sekvenci cílové protilátky. Následně dojde k upřesnění kodonu, syntéze požadovaného genu a produkci konstruktu, tedy rekombinantní protilátky. V okamžiku, kdy je cílová protilátka doručena do laboratoře, dojde k vytvoření expresních konstruktů, které jsou přeneseny do buněčné kultury v procesu označovaném pojmem transfekce. Buněčná kultura začne produkovat cílovou rekombinantní protilátku, ta je pravidelně sbírána, čištěna a analyzována nebo případně použita k dalším experimentům. Pro tvorbu protilátek se používají stabilní buněčné kultury, jako je například Chinese hamester ovary (CHO), buněčná linie z vaječníků čínského křečka nebo human embryonic kidney (HEK293), tedy buňky z lidské embryonální ledviny.[4] V počátcích rozvoje technologie rekombinantních protilátek bylo nutné vyřešit jak uměle vytvořit funkční Fv fragment a spojit těžký a lehký řetězec, takovým způsobem, aby vznikla funkční protilátka.[20] Vytvořit funkční Fv fragment se podařilo v bakterii Escherichia coli. Ukázalo se, že pro funkčnost protilátky je zásadní správné zabalení protilátky.[21] Tyto dva experimenty položily základy dalšímu rozvoji a vylepšování technologií rekombinantních protilátek, které se běžně využívají i dnes.

Monoklonální protilátky hrají zásadní roli v mnohých běžně užívaných terapiích v lidské medicíně. První úspěšná metoda, která vedla k jejich produkci v laboratorních podmínkách byla technologie využívající hybridomy. Poprvé byla tato technologie představena v roce 1975. Velkou výhodou hybridomových buněčných kultur je velké množství protilátek, které jsou schopné vyprodukovat a to v přijatelné kvalitě. [22] Od té doby byly hybridomy využity pro vývoj širokého spektra metod a terapií, včetně medicínských a veterinárních diagnostických a léčebných postupů. Přes veškerý přínos, který hybridomy přinesly vědě, staví před výzkumné týmy překážky a to v podobě etických problémů, možné ztráty exprese cílových rekombinantních protilátek a rozvoje HAMA, jak již bylo zmíněno výše.[4][23] Proto je potřeba tuto technologii doplnit dalšími metodami, které zpřesní produkci protilátek, vazebnou specifitu a množství a sníží míru kontaminace. Přes nevýhody, které s sebou nese využití hybridomů, zůstávají i dnes důležitou součástí vývoje a produkce rekombinantních protilátek, protože často slouží jako původní zdroj monoklonálních protilátek, případně Fab fragmentů, scFv nebo fúzovaných a bispecifických protilátek.[5]

Nejčastěji užívané technologie pro tvorbu rekombinantních protilátek v dnešní vědě a experimentální i aplikované medicíně je bakteriální displej.[2][10][11][12][19][24] Bakteriální displej vede k produkci cílové rekombinantní protilátky na povrchu bakteriofága. Tento přístup umožňuje rychlou a snadnou produkci rekombinantních protilátek v laboratorních podmínkách. Jak scFv tak Fab fragmenty jsou běžně produkovány pomocí bakteriálního displeje.[11] Ze všech možností je nejčastější pro bakteriální displej používána Escherichia coli a to hlavně pro svůj rychlý růst a finančně nenáročné udržování a skladování bakterií.[2][10][11][23]

Při tvorbě scFv fragmentů se nejčastěji uplatňuje jedna ze dvou strategií. První je označována jako nekolineární přístup, funguje na principu heterodimerizace dvou řetězců a vede k tvorbě bispecifických protilátek. Druhá metoda bývá označována jako kolineární a dochází při ní k fúzi dvou rozdílných scFv fragmentů s biologicky aktivním proteinem. [5]