Western blot

První část se skládá z klasické SDS-PAGE elektroforézy, kdy je antigen nanesen do polyakrylamidového gelu a separován v elektrickém poli podle své molekulové hmotnosti. Jednotlivé proteiny vytváří v gelu tzv. zóny (v laboratorním slangu tzv. bandy, z angl. proužky).

Zařízení určené k "mokrému" přenosu při western blotu.

Gel z elektroforézy se následně přiloží na PVDF či nitrocelulosovou membránu a pomocí blotovacího zařízení dojde působením elektrického proudu k přenosu proteinů z gelu na povrch membrány. Na membráně vznikne jakoby „kopie“ proteinů separovaných na gelu. Přístroj je realizován jako soustava anody (spodní díl) a katody (horní díl). Záporně nabité proteiny (obalené SDS) jsou elektrickým proudem přeneseny z gelu směrem dolů, tj. na povrch membrány).

Povrch membrány je nutné tzv. zablokovat, neboť povrch membrány váže proteiny, tj. jak antigen, tak i následně přidané protilátky. Blokování těchto nespecifických míst se nejčastěji provádí umístěním membrány do zředěného roztoku nějakého levného proteinu - např. 3 - 5 % BSA či netučné suché mléko v TBS, s přídavkem slabého detergentu jako je Tween 20 (0,05%). Proteiny BSA či mléčného kaseinu z roztoku se naváží na všechna místa, kam se dosud nenavázaly proteiny při přenosu. Po přidání protilátky se už molekuly imunoglobulinů nemohou nespecificky navázat na prázdný povrch membrány, ale musí specificky „hledat“ svůj epitop na přeblotovaných antigenech. Blokování výrazně snižuje šum pozadí a odstraňuje falešné pozitivity.

Pro zviditelnění daného proteinu je nutné použití specifické protilátky proti tomuto proteinu. Existují dva základní principy detekce, buď dvoukrokový (kombinace primární protilátky a sekundární protilátky konjugované s reportérovým enzymem) či jednokrokový (s reportérovým enzymem je konjugována přímo primární protilátka).

• Dvoukroková detekce:

Po blokování je membrána přenesena do zředěného roztoku primární protilátky (o koncentraci typicky 0,5 - 5 μg/ml) v pufrovaném roztoku (např. TBS či PBS) BSA či mléčného kaseinu. Inkubace s primární protilátkou probíhá za mírného míchání, po dobu od 1 hod. až přes noc, za laboratorní teploty či při 4 °C.

Po opláchnutí membrány pufrovaným roztokem detergentu (např. PBS+ 0,05% Tween 20) je membrána přenesena do roztoku sekundární protilátky - komerčně dodávané protilátky proti celé škále primárních protilátek, nejčastěji jsou to sekundární protilátky proti myším či králičím proteinům (což jsou skoro vždy primární protilátky). Tyto sekundární protilátky vázající primární protilátky jsou konjugovány s nějakým reportérovým enzymem umožňující vizualizaci - např. křenovou peroxidasou (HRP, z angl. horseradish peroxidase) či alkalickou fosfatázou (AP, z angl. alcalic phosphatase).

• Jednokroková detekce:

Při jednokrokové detekci je reportérovým enzymem značena přímo primární protilátka - většinou se tedy jedná o komerčně dodávané primární protilátky proti často používaným proteinům či tagům, např. proti proteinu GFP, či FLAG-tagu, hemaglutininovému (HA) tagu, His-tagu apod.

• kolorimetrický způsob: využívá reakce reportérového enzymu (např. peroxidázy) s chromogenním substrátem. Enzym přeměňuje rozpustný (a bezbarvý) substrát na nerozpustný a barevný (např. modrý) produkt. Množství proteinu je poté semikvantitativně stanoveno densitometrií („jak moc barevná je daná skvrna“).

• chemiluminiscenční způsob: reportérový enzym (peroxidáza) přeměňuje chemilumiscenční substrát na nestabilní produkt, který se stabilizuje vyzářením kvanta světla. Množství světla je poté úměrné množství peroxidázy, které je přímo úměrné množství daného proteinů. Uvolňované světlo je pak detekováno buď přiložením světlocitlivého filmu, anebo nověji použitím CCD-kamer. Pro kvantifikaci je opět možné použít densitometrii.

Výsledky western blotu u pacienta testovaného na HIV.