Izoelektrická fokusácia

Izoelektrická fokusácia je elektromigračná separačná metóda proteínov.

Delenie touto metódou prebieha na základe migrácie proteínov v prostredí premenlivého pH. V zásaditom prostredí majú proteíny záporný náboj a putujú teda k anóde. V kyslom prostredí naopak majú celkový náboj kladný a putujú ku katóde. V pH rovnom izoelektrickému bodu, pI, je molekula neutrálna.

Izoelektrická fokusácia prebieha najčastejšie na polyakrylamidovom géle s imobilizovaným pH gradientom prípadne v kapiláre s pH gradientom tvoreným zmesou nízkomolekulárnych amfolytov. Po aplikácii napätia potom putuje proteín do miesta svojho izoelektrického bodu a na tomto mieste sa fokusuje (sústreďuje), pretože v tomto bode sa celkový náboj bielkoviny vynuluje. Ak by bielkovina vyputovala z izoelektrického bodu okamžite získa náboj a vďaka napätiu sa vráti späť do izoelektricého bodu. Izoelektrickou fokusáciou je možné dosiahnuť separácie bielkovín, ktoré sa líšia v hodnotách izoelektrických bodov iba o 0,01.

Gradient pH je vytváraný zmesou niekoľkých sto až tisíc rôznych nízkomolekulárnych amfolytov tak, aby spektrum ich izoelektrických bodov dokonale pokrylo požadovaný rozsah pH gradientu (najčastejšie pH 3 - 10). Póry gélu bývajú volené veľké, aby nedochádzalo k narúšaniu separácie sieťovým javom. Používajú sa vysoké hodnoty napätia v rádoch jednotiek až desiatok kilovoltov.

Izoelektrická fokusácia je prvým krokom 2D-elektroforézy.